孢子萌發(fā)對(duì)于細(xì)菌定殖是必要的第一步,孢子在結(jié)腸中的萌發(fā)速率依賴于宿主菌群的組成,宿主菌群可調(diào)控初級(jí)及次級(jí)膽鹽水平以控制艱難梭菌的孢子萌發(fā)。Biosensors and Bioelectronics上發(fā)表了一項(xiàng)最新研究,基于萌發(fā)的孢子有著更高的凈電導(dǎo)率這一特征,開發(fā)了一種基于阻抗檢測(cè)的高通量單細(xì)胞計(jì)數(shù)法(Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀,瑞士Amphasys),僅需4小時(shí)(傳統(tǒng)方法需24小時(shí))即可評(píng)估艱難梭菌的孢子萌發(fā)情況,并可用于評(píng)估宿主菌群對(duì)艱難梭菌感染的易感性。
① 利用高通量單細(xì)胞阻抗計(jì)數(shù)法(>300 events/s)對(duì)活細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行定量;
② 相比于傳統(tǒng)的菌落分析方法(需24h),該方法僅需培養(yǎng)4h即可評(píng)估孢子萌發(fā)情況,檢測(cè)下限為每50μL樣本中約100個(gè)活細(xì)胞;
③ 萌發(fā)的艱難梭菌孢子有更高的凈電導(dǎo)率,這在中等導(dǎo)電介質(zhì)(0.8S/m)內(nèi)造成了獨(dú)特的高頻(10 MHz)阻抗相分散(活細(xì)胞與失活細(xì)胞離散);
④ 該方法可對(duì)比在不同的初級(jí)膽鹽水平下的艱難梭菌孢子萌發(fā)速率,并可用于評(píng)估宿主對(duì)艱難梭菌感染的易感性。
圖1(a) 艱難梭菌孢子萌發(fā)到其營(yíng)養(yǎng)體形式受到“正?!本褐泄采?xì)菌的抑制,該菌群分泌水解酶,能夠代謝初級(jí)膽鹽為次級(jí)膽鹽,而缺乏共生細(xì)菌的抗生素破壞菌群表現(xiàn)出較高的初級(jí)至次級(jí)膽鹽水平,導(dǎo)致孢子萌發(fā)增強(qiáng);(b) 整體實(shí)驗(yàn)時(shí)間表:包括孢子預(yù)處理、細(xì)菌生長(zhǎng)、IFC(阻抗流式細(xì)胞儀)微流控表型分析和菌群驗(yàn)證;(c)阻抗式細(xì)胞儀分析的具體樣品制備步驟;(d) 來自抗生素處理的小鼠模型的宿主菌群樣本的采集、制備和分析步驟。圖2 艱難梭菌UK1孢子在不同水平牛磺膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的微生物學(xué)分析圖2(a) 24小時(shí)內(nèi)的生長(zhǎng)曲線顯示,隨著牛磺膽酸鹽水平的增加,孢子萌發(fā)率逐漸提高,由于營(yíng)養(yǎng)性艱難梭菌的存在, 0.001% 、0.01%和 0.1%牛磺膽酸鹽水平下的吸光度分別在20h、18h、15h(用虛線標(biāo)記)與無?;悄懰猁}的對(duì)照組的吸光度相比,出現(xiàn)顯著差異(*p<0.05);(b) 24小時(shí)后的CFU分析結(jié)果顯示,含有0.1%?;悄懰猁}的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)顯著(****p<0.0001),而其他?;悄懰猁}水平下孢子萌發(fā)并不明顯;(c)培養(yǎng)4小時(shí)后的DEP歸一化光譜和頻譜結(jié)果顯示,含有0.1%牛磺膽酸鹽的DEP歸一化光譜與同質(zhì)營(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌勻質(zhì)樣品的DEP歸一化光譜(實(shí)線)極為相似,根據(jù)異質(zhì)樣本的凈電生理特性可以推斷,在0.1%?;悄懰崽幚淼臉颖局写嬖跔I(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌亞群,這與傳統(tǒng)法分析(圖2a和b)的評(píng)估結(jié)果一致,但檢測(cè)可在更短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行(4小時(shí).VS >15小時(shí))。圖3 營(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞和孢子的多殼層介電模型&均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜
圖3(a) 基于營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和孢子的大小、形狀和結(jié)構(gòu)差異,生成多殼層介電模型;(b) 營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和孢子均質(zhì)種群的歸一化DEP光譜結(jié)果表明,不同樣品類型的極化和電生理特性存在明顯差異。低于100 kHz的電場(chǎng)頻率下,營(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞因絕緣細(xì)胞外殼表現(xiàn)為nDEP(負(fù)DEP),但在高于1 MHz的電場(chǎng)頻率下,營(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌因細(xì)胞內(nèi)部的導(dǎo)電細(xì)胞質(zhì)而發(fā)生極化,表現(xiàn)出pDEP(正DEP)。圖4 不同頻率、介質(zhì)電導(dǎo)率下,艱難梭菌活細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)體與熱滅活后的艱難梭菌細(xì)胞的阻抗數(shù)據(jù)(相位-振幅)疊加圖(IFC法)由于孢子萌發(fā)過程中樣品的異質(zhì)性,研究可利用Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC法)通過檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌的電生理學(xué)特征來鑒定孢子萌發(fā),并量化營(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌的比例。圖4為不同頻率(0.5 MHz (a & d)、2 MHz (b & e)、10 MHz (c & f))、不同介質(zhì)導(dǎo)電條件(0.5× PBS(a-c)、1× PBS(d–f) )下,艱難梭菌活細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)體與熱滅活后的艱難梭菌細(xì)胞的阻抗數(shù)據(jù)(相位-振幅)疊加圖。對(duì)比可知,0.5× PBS(介質(zhì)電導(dǎo)率為 0.8 S/m),10 MHz 下二者的區(qū)分度最佳,篩選門控可設(shè)于218°相位處(圖4c實(shí)線),此時(shí)艱難梭菌活細(xì)胞占比>95%。圖5 不同?;悄懰猁}水平、不同培養(yǎng)時(shí)間下艱難梭菌活細(xì)胞的占比(IFC法:0.5× PBS,10 MHz)圖5顯示孢子萌發(fā)率隨生長(zhǎng)培養(yǎng)基中?;悄懰猁}水平以及萌發(fā)時(shí)間的增加而增加,其中0.1% ?;悄懰猁}的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 小時(shí)后,孢子萌發(fā)率約為 30%(每50μL 樣品約 250 個(gè)營(yíng)養(yǎng)體艱難梭菌細(xì)胞),而0.05–0.1%?;悄懰猁}的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中萌發(fā) 5 小時(shí)后,孢子的萌發(fā)率可達(dá)80%以上;該測(cè)定結(jié)果表明艱難梭菌對(duì)培養(yǎng)時(shí)間和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中初級(jí)膽汁鹽(?;悄懰猁})比例的變化表現(xiàn)出良好的敏感性。圖6 未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)比較(宿主菌體外菌群)本研究使用從小鼠模型獲得的體外菌群樣品進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在使用克林霉素進(jìn)行抗生素治療10天后,按照?qǐng)D1d的步驟進(jìn)行了艱難梭菌孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。CFU分析(圖6a)結(jié)果顯示,未經(jīng)處理的菌群的孢子發(fā)芽率明顯較低,而克林霉素處理的菌群培養(yǎng)24小時(shí)后,孢子萌發(fā)水平顯著提高(**p<0.01),表明抗生素處理后菌群多樣性的減少可能會(huì)提高艱難梭菌的萌發(fā)率,這與此前的研究結(jié)果一致。而使用阻抗流式細(xì)胞儀(IFC法)在培養(yǎng)4小時(shí)后即可檢測(cè)出未處理和抗生素處理的艱難梭菌孢子萌發(fā)率(***p<0.001,圖6b)和孢子數(shù)量(**p<0.01,圖6c)上的顯著差異。這表明與CFU法相比,IFC法具有更高的靈敏性,可以更早檢測(cè)出宿主菌群對(duì)艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異(4h與 24 h)。綜上所述,Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC法)可用于識(shí)別艱難梭菌營(yíng)養(yǎng)體,量化宿主菌群對(duì)艱難梭菌孢子萌發(fā)率的影響,并在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出宿主菌群對(duì)艱難梭菌孢子萌發(fā)的敏感性差異。該方法檢測(cè)靈敏度高、測(cè)量快速、樣品制備簡(jiǎn)單,有潛力進(jìn)一步用于CDI臨床測(cè)量的基準(zhǔn)測(cè)試,調(diào)查抗生素治療下腸道菌群隨時(shí)間變化的敏感性差異,并通過初始和復(fù)發(fā)艱難梭菌感染的易感性指導(dǎo)臨床管理決策。John H. Moore et al. Quantifying bacterial spore germination by single-cell impedance cytometryfor assessment of host microbiota susceptibility to Clostridioides difficileinfection. Biosensors and Bioelectronics, Volume 166, 2020, 112440, ISSN0956-5663.
相關(guān)閱讀: