腫瘤患者來(lái)源的異種移植(PDX)是進(jìn)行化療藥物敏感性和毒性評(píng)估的有效手段，對(duì)預(yù)測(cè)化療療效至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡可為吞噬細(xì)胞清除細(xì)胞提供重要信號(hào)，也可調(diào)控廣泛微環(huán)境中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞凋亡首先在細(xì)胞表面形成質(zhì)膜泡，隨后產(chǎn)生薄膜包埋，包括質(zhì)膜上的微管峰、凋亡和珠狀結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂和細(xì)胞物質(zhì)分布到亞細(xì)胞體和小微泡中。所有這些具有不同大小、形狀和內(nèi)部組成的膜結(jié)合凋亡細(xì)胞外小泡（1-5μm）統(tǒng)稱為凋亡小體（ABs）。在藥物處理下分泌到培養(yǎng)基中的亞細(xì)胞凋亡小體(ABs)和微泡（MVs），可作為藥物敏感性的標(biāo)志物。目前，實(shí)體瘤的體外藥物敏感性評(píng)估主要通過：一、對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡鏡檢分析ABs細(xì)胞的數(shù)量和形狀；二、流式細(xì)胞儀測(cè)量統(tǒng)計(jì)凋亡條件下ABs和細(xì)胞的數(shù)量，并根據(jù)熒光染色結(jié)果鑒定細(xì)胞大小并進(jìn)行分類。然而由于ABs復(fù)雜多樣，很難確定每種AB型的適配熒光染料并預(yù)估ABs對(duì)不同染料滲透動(dòng)力學(xué)的依賴性，因此利用流式細(xì)胞儀量化細(xì)胞分解過程存在極大的挑戰(zhàn)。阻抗流式細(xì)胞儀（Ampha Z32，Amphasys AG）作為一種測(cè)量單細(xì)胞電生理學(xué)特性的有效工具，已廣泛應(yīng)用于無(wú)標(biāo)記高通量無(wú)損評(píng)估細(xì)胞的活力與數(shù)量。近期，美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)的科研人員利用阻抗流式細(xì)胞儀Ampha Z32測(cè)定分析了經(jīng)吉西他濱處理的胰腺腫瘤培養(yǎng)基上清液中ABs，所得測(cè)量結(jié)果（高頻阻抗相位與大小分布）與常規(guī)方法提取出的凋亡細(xì)胞所表現(xiàn)出表型特征一致，結(jié)合介電質(zhì)多殼模型還可用于ABs分類（基于尺寸和形狀），如：具有低阻抗相位（＜0.3）的＜2.6μm小球形囊泡；具有高阻抗相位（＜0.5）的中等尺寸扁球形囊泡（3-8μm）；以及可能由球形或長(zhǎng)形囊泡產(chǎn)生的具有低阻抗相位（＜0.3）的較寬尺寸囊泡（3-14μm），這是常規(guī)流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，BD Biosciences）所不能實(shí)現(xiàn)的?？梢?，阻抗流式細(xì)胞儀（Ampha Z32，Amphasys AG）可作為檢測(cè)胰腺腫瘤微環(huán)境模型培養(yǎng)基中的ABs的有效工具，準(zhǔn)確評(píng)估患者源性腫瘤對(duì)化療藥物的藥物敏感性和毒性。
圖1 A）建立胰腺癌（PDAX）患者來(lái)源的異種移植模型測(cè)定對(duì)吉西他濱的藥物敏感性；B）阻抗流式細(xì)胞儀（Ampha Z32，Amphasys AG）檢測(cè)示意圖；C）吉西他濱誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞解體產(chǎn)生的各種表型和形態(tài)的凋亡小體ABs
圖1B 阻抗流式細(xì)胞儀（Ampha Z32，Amphasys AG）信號(hào)的采集和轉(zhuǎn)導(dǎo)A）細(xì)胞在不同頻率的交流電場(chǎng)中的檢測(cè)結(jié)果，低頻下反映細(xì)胞的體積特性，高頻下反映細(xì)胞膜的介電特性即細(xì)胞活性；B) 微流控芯片；C）流經(jīng)交流電場(chǎng)的細(xì)胞的阻抗信號(hào)（藍(lán)色實(shí)部即電阻信號(hào)，綠色虛部即容性電抗信號(hào)），細(xì)胞膜完整性決定容性電抗的大小，故可通過虛部信號(hào)來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，最終以阻抗相位角-振幅散點(diǎn)圖反映出來(lái)阻抗流式細(xì)胞儀（Ampha Z32，Amphasys AG），通過檢測(cè)流經(jīng)交流電場(chǎng)的細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞的電阻抗信號(hào)，分析獲得細(xì)胞的數(shù)量、大小、活性。該儀器可以在0.3-30MHz的范圍內(nèi)同時(shí)測(cè)量4個(gè)不同頻率下細(xì)胞的電阻抗特性，適配微流控芯片通道尺寸范圍為15-400μm（圖1B），可滿足0-300μm范圍內(nèi)的任意生物、非生物單細(xì)胞的活性測(cè)量。電場(chǎng)中活細(xì)胞的等效電路由電阻（細(xì)胞質(zhì)）和電容（細(xì)胞膜）組成，在笛卡爾坐標(biāo)系中，阻抗Z（ω）可以描述為實(shí)部分Zr（ω）或電阻與虛部分Zi（ω）或容性電抗的矢量和。
相位角（θ）描述電阻和電抗之間的關(guān)系：
圖2 流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，BD Biosciences）評(píng)估吉西他濱誘導(dǎo)下PDAC細(xì)胞系的凋亡變化
其中圖2A）顯示了暴露于不同濃度（0.01、0.1和1 μg·mL-1）吉西他濱下的PDAC細(xì)胞系在不同處理時(shí)間[24 h（●）、48 h（■）和 96 h（▲）]的相對(duì)于對(duì)照組的增值狀態(tài)（%）。從圖中可以看出，0.01 μg·mL-1的藥物濃度下，短時(shí)間內(nèi)（24 h和48 h）幾乎對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，而0.1和1 μg·mL-1的藥物濃度下48h和96h后，細(xì)胞增殖水平急劇下降至≈-50%。也就是說隨藥物劑量增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖下降，這說明吉西他濱對(duì)PDAC細(xì)胞系有化療效果。圖2B)為不同濃度吉西他濱下暴露48h后的PDAC細(xì)胞顯微圖像（63 obj，2.5optovar，Zeiss Observer 7），其中凸起（0.01 μg·mL-1）、氣泡（0.1 μg·mL-1）及珠狀結(jié)構(gòu)（1 μg·mL-1）均為細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵特征，會(huì)進(jìn)一步形成具有特定組成和結(jié)構(gòu)的ABs。圖2C)對(duì)不同濃度吉西他濱下暴露48h后的PDAC細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析所得到細(xì)胞（i-iv）和亞細(xì)胞（v-viii）的密度散點(diǎn)圖。其中膜聯(lián)蛋白V (AnnexinV)與DAPI作為染色標(biāo)記物。圖中AV-DAPI-門控內(nèi)為未染色的活細(xì)胞；AV＋DAPI-門控內(nèi)為細(xì)胞膜完整的處于凋亡早期至中期的細(xì)胞；DAPI＋門控內(nèi)為具有通透性膜的失活細(xì)胞。圖2D)和E)分別為不同濃度不同暴露時(shí)間下，細(xì)胞（Cells）和亞細(xì)胞（Sub-Cells）中AV-DAPI-、AV+DAPI-和DAPI+門控中的亞群占比。其中在高濃度吉西他濱治療條件下（48 h，0.1和1 μg·mL-1），DAPI+細(xì)胞的比率降低，其中AV＋DAPI-細(xì)胞（即早期/中期凋亡細(xì)胞）的比率顯著增加（圖2D），表明此時(shí)藥物開始誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；AV＋DAPI-亞細(xì)胞比例從≈10–30%上升至≈60%（圖2E），這可能對(duì)應(yīng)于凋亡細(xì)胞分解過程中產(chǎn)生的較大的ABs。圖2C-vii、viii中的箭頭指示出不同的ABs亞型，但由于遺傳物質(zhì)和膜構(gòu)象的差異，不同ABs亞型需要適配不同的染色劑，故很難通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行具體區(qū)分。
圖3 阻抗流式細(xì)胞儀（Ampha Z32，Amphasys AG）評(píng)估吉西他濱誘導(dǎo)下PDAC細(xì)胞系的凋亡變化圖3中A-D分別為不同濃度（0、0.01、0.1和1 μg·mL-1）的吉西他濱下暴露于48 h后的PDAC細(xì)胞電直徑與阻抗相位的密度散點(diǎn)圖。其中，阻抗流式細(xì)胞儀在低頻電場(chǎng)(0.5 MHz)下測(cè)量得到的細(xì)胞阻抗振幅(IZI)可用于評(píng)估細(xì)胞的電直徑（），而在高頻電場(chǎng)（18 MHz）下的阻抗相位（）則可用來(lái)評(píng)估細(xì)胞的介電特性，7 μm聚苯乙烯珠的電直徑-阻抗相位值可作為參考設(shè)置細(xì)胞和亞細(xì)胞門控。圖E）和F）分別顯示了在不同濃度藥物下，阻抗流式細(xì)胞儀和流式細(xì)胞儀分析獲得的細(xì)胞和亞細(xì)胞的占比，從圖中可以看出，0.1和1 μg·mL-1藥物水平下的細(xì)胞占比顯著下降（*p<0.05），這是由于藥物治療下，PDAC細(xì)胞凋亡并促使亞細(xì)胞凋亡小體ABs的釋放。
圖4 A-C分別為不同藥物濃度、不同暴露時(shí)間下，A）細(xì)胞亞群的占比的變化；B）細(xì)胞的阻抗相位變化以及C）亞細(xì)胞的阻抗相位變化；D）細(xì)胞與E）亞細(xì)胞的歸一化阻抗相位（φZ(yǔ)18 MHz）分布趨勢(shì)（對(duì)照組與暴露于1 μg·mL-1吉西他濱下24 h和48 h的處理組，以7 μm聚苯乙烯珠在18 MHz下的阻抗相位（φZ(yǔ)18 MHz）為參考進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理）；F）暴露于不同濃度吉西他濱下24 h和48 h的細(xì)胞和亞細(xì)胞與對(duì)照組的差分阻抗相位比較。從圖中可以看出，細(xì)胞及亞細(xì)胞阻抗相位均隨著藥物濃度升高及暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這是由于隨細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞內(nèi)部電導(dǎo)率（σint）下降，從而反映出細(xì)胞阻抗相位的下降，這與使用雙相電泳觀察到的凋亡細(xì)胞所反映出的狀態(tài)一致，這種效應(yīng)可能與細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)離子（主要是K+和Na+）的流出有關(guān)。特別值得注意的是，阻抗流式細(xì)胞儀（Ampha Z32，Amphasys AG）對(duì)細(xì)胞凋亡過程的捕捉比流式細(xì)胞儀更為靈敏，其可在較低藥物濃度（和暴露時(shí)間）下檢測(cè)出細(xì)胞阻抗相位的變化（圖4D、E與圖2C、D）?？傮w來(lái)看，細(xì)胞和亞細(xì)胞的歸一化阻抗相位（圖4D、E）分布趨勢(shì)相似，但亞細(xì)胞群體的阻抗相位下降幅度更大，這說明兩個(gè)類群的表型相似，但亞細(xì)胞對(duì)凋亡的發(fā)生更加敏感。根據(jù)阻抗相位的變化，或可進(jìn)一步進(jìn)行各種ABs亞型，如：較小的微泡、ABs珠狀聚集體和細(xì)胞解體產(chǎn)生的較大ABs（圖1C）的分類研究。
圖5 阻抗流式細(xì)胞儀與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果比較為優(yōu)化阻抗流式細(xì)胞儀（AmphaZ32，Amphasys AG）單細(xì)胞檢測(cè)的信噪比，以識(shí)別不同ABs亞型的電生理學(xué)的差異，本研究利用5μm聚苯乙烯參考珠的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行尺寸標(biāo)準(zhǔn)化，并結(jié)合單一頻率的（10 MHz）阻抗相位和電直徑結(jié)果繪制了對(duì)照組（圖5A）和1 μg·mL-1吉西他濱處理組（圖5B）的ABs電直徑-阻抗相位3D密度分布圖。對(duì)比可見，對(duì)照組與處理組細(xì)胞數(shù)量存在顯著差異（圖C，**p＜0.01），且處理組含有三個(gè)不同ABs亞群：低阻抗相位的小囊泡（＜0.3）、高阻抗相位的中型亞細(xì)胞體（＞0.5）和低阻抗相位的較大尺寸的亞細(xì)胞體（＜0.3）。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果同樣顯示出對(duì)照組與處理組細(xì)胞數(shù)量間的顯著差異（圖F，**p＜0.01），但卻無(wú)法從FSC、SSC或膜聯(lián)蛋白V染色結(jié)果進(jìn)行ABs亞群尤其是較大尺寸（中值電直徑＞2.6 μm）亞群的區(qū)分（圖5D，F(xiàn)）。
暴露于1 μg·mL-1吉西他濱下48 h的處理組ABs在10 MHz下的阻抗相位分布如圖中圖6A）和B）中實(shí)線所示。為對(duì)ABs表型進(jìn)行準(zhǔn)確分類，本研究通過單一高斯分布（圖6A，A-1高斯模型R2=0.9686）來(lái)擬合確定＜2.6 μm的ABs亞群的阻抗相位分布的峰值位置（0.28），通過雙高斯分布（圖6B虛線，B-2高斯模型R2=0.9852）擬合確定電直徑＞2.6 μm的ABs亞群（對(duì)應(yīng)圖5B的兩個(gè)亞群）阻抗相位分布的峰值位置（0.29和0.59）。顯微鏡觀察到亞細(xì)胞體呈球形、扁長(zhǎng)形和扁圓形（圖1C）等多種亞型，形狀因細(xì)胞系、藥物誘導(dǎo)等因素而異。我們雖然很難通過阻抗流式細(xì)胞儀直接識(shí)別出這些形狀特征，但卻可以利用不同形狀對(duì)電極化的強(qiáng)烈影響而產(chǎn)生的阻抗數(shù)據(jù)差異進(jìn)行形狀的區(qū)分。本研究基于ABs球形度-電直徑變化所引起的阻抗相位（φZ(yǔ)10 MHz）的變化創(chuàng)建了ABs表型的介電多殼模型，該模型（圖6C）可顯示特定大小和形狀下的ABs阻抗相位（φZ(yǔ)10 MHz）的差異，其中有低阻抗相位（＜0.3）的＜2.6μm的為小球形囊泡，高阻抗相位（＜0.5）的中等尺寸扁球形囊泡（3-8 μm），以及可能由球形或長(zhǎng)形囊泡產(chǎn)生的具有低阻抗相位（＜0.3）的較寬尺寸的囊泡（3-14 μm）。此研究表明，阻抗流式細(xì)胞儀可高通量快速無(wú)損評(píng)估患者源性腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，不僅免除了費(fèi)力耗力的細(xì)胞收集和染色標(biāo)記過程，還可避免因染色不當(dāng)所造成的細(xì)胞凋亡。除此之外，阻抗流式細(xì)胞儀還可在不同的腫瘤微環(huán)境模型和藥物類型下通過追蹤ABs表型來(lái)確定細(xì)胞凋亡過程，以更準(zhǔn)確的衡量藥物敏感性和毒性。
