Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）可在單細(xì)胞水平上快速表征大量細(xì)胞活性狀態(tài)。測(cè)試全過(guò)程無(wú)需使用任何標(biāo)記物和染料，基于懸浮液中單細(xì)胞本身的電阻抗特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活性的在線、高通量、快速、無(wú)損檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)使用Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）測(cè)試了不同培養(yǎng)狀態(tài)下BL2細(xì)胞（起源于Burkitt淋巴瘤）的活性和濃度，并觀察了細(xì)胞凋亡過(guò)程的阻抗相位響應(yīng)。
Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）核心部件是微流控芯片，當(dāng)懸浮的細(xì)胞被泵入微芯片后，在外加交流電場(chǎng)作用下，不同活性狀態(tài)的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生不同的阻抗信號(hào)。細(xì)胞大小、細(xì)胞膜活性（離子泵）、細(xì)胞內(nèi)部特性（如液泡或脂質(zhì)外殼）都會(huì)影響細(xì)胞所產(chǎn)生的阻抗信號(hào)。在變化的電場(chǎng)頻率下，儀器即可捕捉到細(xì)胞的這些特性，本儀器可以在0.3-30MHz范圍內(nèi)的電場(chǎng)頻率下同時(shí)檢測(cè)4個(gè)不同頻率下細(xì)胞的電阻抗特性，如低頻（0.1-0.5MHz）和中頻（0.5-5MHz）分別捕捉有關(guān)細(xì)胞體積和細(xì)胞膜性能的信息，而更高頻率（>5MHz）中則更傾向于探測(cè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)特性。
圖1 A）Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀；B）微流控芯片
阻抗原始信號(hào)由實(shí)部（電阻）和虛部（容性電抗）組成（圖2B），經(jīng)信號(hào)分析后在AmphaSoft軟件中以相位-振幅散點(diǎn)圖的形式輸出（圖3）。散點(diǎn)圖上每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)測(cè)細(xì)胞的阻抗響應(yīng)。根據(jù)樣品細(xì)胞濃度的不同，每秒可以分析數(shù)百到上千個(gè)細(xì)胞。
圖2 BL2細(xì)胞的阻抗信號(hào)
A) 每秒的原始信號(hào)。每個(gè)振幅對(duì)應(yīng)于細(xì)胞通過(guò)微流控芯片電場(chǎng)時(shí)的信號(hào)。B) 部分原始信號(hào)的放大，顯示了兩個(gè)活細(xì)胞和一個(gè)死細(xì)胞的阻抗響應(yīng)。原始信號(hào)由實(shí)部（藍(lán)線）和虛部（綠線）組成。通過(guò)識(shí)別實(shí)部和虛部信號(hào)的峰值，換算成每個(gè)細(xì)胞的相位角和振幅。
AmphaSoft軟件可直觀的輸出每個(gè)測(cè)試樣品的相位-振幅散點(diǎn)圖，并進(jìn)行活性-失活類群分析、不同樣品的疊加分析以及選定類群的統(tǒng)計(jì)分析，并可以.CSV，.HTML及.PNG格式輸出綜合報(bào)告和結(jié)果。此外，針對(duì)不同樣品的測(cè)試模板方便用于同系列和同類型樣品的重復(fù)測(cè)量和比較。
圖3 BL2的相位-振幅散點(diǎn)圖
如圖3所示，在10 MHz測(cè)量頻率下，該培養(yǎng)狀態(tài)的BL2細(xì)胞的活性為83.37%。相位-振幅散點(diǎn)圖的頂部和右側(cè)分別顯示了相位直方圖和振幅直方圖。當(dāng)使用多個(gè)頻率測(cè)量細(xì)胞時(shí)，AmphaSoft軟件可在同一個(gè)界面輸出每個(gè)頻率的測(cè)量結(jié)果，直觀對(duì)比細(xì)胞對(duì)不同頻率的阻抗響應(yīng)。上圖散點(diǎn)圖中的左側(cè)類群對(duì)應(yīng)于死細(xì)胞，而右側(cè)類群對(duì)應(yīng)于活細(xì)胞。顏色差異顯示了細(xì)胞的密集程度。
Ampha Z32的測(cè)試流程
Ampha Z32測(cè)量過(guò)程無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，且樣品的使用量很小。測(cè)量前只需經(jīng)過(guò)稀釋、添加測(cè)量緩沖液和過(guò)濾三個(gè)步驟。
（一）從細(xì)胞培養(yǎng)液中取樣，通常僅需50–100μl；
（二）根據(jù)細(xì)胞類型和應(yīng)用，選取合適的測(cè)量緩沖液稀釋樣品；
對(duì)于BL2細(xì)胞而言，使用AF6測(cè)量緩沖液。通常，如果直接從培養(yǎng)液中提取樣品，則建議在1:1到1:10之間稀釋。
（三）過(guò)濾以去除顆粒團(tuán)塊；此步驟取決于細(xì)胞培養(yǎng)物的大小、純度以及顆粒與芯片通道橫截面的比率。
對(duì)于BL2細(xì)胞，不需要過(guò)濾步驟。
（四）上樣測(cè)量；測(cè)試過(guò)程全自動(dòng)，并在達(dá)到某個(gè)設(shè)定停止條件（時(shí)間、細(xì)胞數(shù)量、體積）或用戶手動(dòng)停止測(cè)量時(shí)結(jié)束。
不同培養(yǎng)時(shí)期BL2細(xì)胞的活力
活的和失活的BL2細(xì)胞的阻抗信號(hào)有明顯的差異（圖2B）。在相位-振幅點(diǎn)圖中，兩者歸屬于不同的散點(diǎn)云類群。失活細(xì)胞在低阻抗相位角形成一個(gè)封閉的云群，而活細(xì)胞通常在高阻抗相位角形成一個(gè)分布更廣泛的云群。對(duì)處于不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)胞，隨著細(xì)胞開始凋亡和死亡，活細(xì)胞云群的相位角逐漸減小。
圖4 不同培養(yǎng)時(shí)期BL2細(xì)胞的活力分析
圖5 不同培養(yǎng)時(shí)期BL2細(xì)胞的阻抗相位和細(xì)胞活力的變化
圖5顯示BL2細(xì)胞在培養(yǎng)的0、1、2和6天內(nèi)阻抗相位和細(xì)胞活力的變化。從圖中可以看到，在第1天之后，BL2活細(xì)胞群發(fā)生明顯相移且細(xì)胞活力的急劇下降。
BL2細(xì)胞濃度
除了細(xì)胞活力之外，Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀還可準(zhǔn)確測(cè)量BL2的總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞和死細(xì)胞濃度。為了確定濃度的線性測(cè)量范圍，本實(shí)驗(yàn)制備了一系列稀釋液。
● 以1,500rpm的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞離心2分鐘來(lái)收集BL2細(xì)胞樣品，然后棄去上清液并用新鮮的測(cè)量緩沖液重新懸浮細(xì)胞。
● 之后按1:3、1:9和 1:27稀釋濃度制備稀釋液，并重復(fù)測(cè)量三次。
● 使用Neubauer計(jì)數(shù)板對(duì)1:3稀釋液進(jìn)行定量。
一系列稀釋液的測(cè)量結(jié)果顯示如圖6A所示，兩種檢測(cè)方法的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示出高度的線性一致性。然而高濃度細(xì)胞（> 2×106個(gè)cells/ml）會(huì)導(dǎo)致Ampha Z32的阻抗信號(hào)重疊，這是由于高濃度下，多個(gè)細(xì)胞容易緊密通過(guò)或重合通過(guò)微流控芯片（圖5C），這將導(dǎo)致細(xì)胞濃度被低估。此時(shí)可使用測(cè)量緩沖液調(diào)整稀釋倍數(shù)，使樣品濃度達(dá)到合適的測(cè)定范圍。圖5B中的結(jié)果表明Ampha Z32活力測(cè)定結(jié)果的可重復(fù)性極高，且不受細(xì)胞濃度影響。
圖6 Ampha Z32測(cè)試的合理濃度范圍
A) IFC法與Neubauer計(jì)數(shù)板的相關(guān)性分析（n=3，sd=±3%）；B) 不同稀釋倍數(shù)下的細(xì)胞活力，細(xì)胞活力不受細(xì)胞濃度的影響（非配對(duì)t檢驗(yàn)，p>0.05）;C) 原始樣品和按1:27稀釋后，細(xì)胞阻抗信號(hào)示例（2MHz頻率下）。高濃度原始樣本出現(xiàn)干擾信號(hào)（最左邊的信號(hào)）和雙峰信號(hào)（虛線框），這是由于細(xì)胞緊密通過(guò)或重合通過(guò)微流控芯片。相比之下，1:27稀釋后的樣品具有更明顯和離散的粒子信號(hào)。
BL2細(xì)胞的凋亡過(guò)程
Staurosporine是一種蛋白激酶抑制劑和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。圖7顯示在Staurosporine誘導(dǎo)下，BL2活細(xì)胞群的阻抗信號(hào)變化（相移），直到細(xì)胞全部死亡。
從該誘導(dǎo)過(guò)程（圖7）以及培養(yǎng)過(guò)程（圖4A）中細(xì)胞阻抗信號(hào)的變化可以發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞從高相位角（≈325°，活細(xì)胞和增殖細(xì)胞）經(jīng)中間過(guò)渡狀態(tài)（細(xì)胞凋亡）到低相位角（≈235°，死細(xì)胞）。因此，相位角可以作為指示細(xì)胞狀態(tài)的一個(gè)有效指標(biāo)。
圖7 Staurosporine誘導(dǎo)下BL2細(xì)胞的凋亡過(guò)程
A）Staurosporine誘導(dǎo)后，BL2細(xì)胞相位直方圖隨時(shí)間的變化?；罴?xì)胞群在誘導(dǎo)初期(t<10min)快速發(fā)生相移，之后穩(wěn)步發(fā)生變化，直到細(xì)胞開始死亡(t>1.5h)。該相位直方圖10MHz電場(chǎng)頻率下獲得。B）Staurosporine誘導(dǎo)的50個(gè)小時(shí)內(nèi)，BL2細(xì)胞活力的變化過(guò)程。從圖中可以看出，接觸Staurosporine誘導(dǎo)1.5h后，BL2細(xì)胞的活力迅速下降，此時(shí)對(duì)照組（DMSO誘導(dǎo)）BL2細(xì)胞仍處于生長(zhǎng)狀態(tài)。18h后，對(duì)照組BL2細(xì)胞活力才開始降低。
結(jié)論
本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀是一種在單細(xì)胞水平上測(cè)量細(xì)胞電特性的強(qiáng)大的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)方法，并可以>1,000個(gè)Cells/s的采集速率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高通量檢測(cè)。每個(gè)細(xì)胞的測(cè)量阻抗數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)顯示在相位-振幅散點(diǎn)圖中，測(cè)量結(jié)束后可以快速識(shí)別和量化活細(xì)胞和死細(xì)胞，并獲得各自的細(xì)胞濃度。此外，根據(jù)阻抗相位的變化還可準(zhǔn)確預(yù)判細(xì)胞狀態(tài)，即細(xì)胞的存活、凋亡或死亡。
因此，我們認(rèn)為Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）是一種可以無(wú)標(biāo)記、快速表征細(xì)胞狀態(tài)的檢測(cè)技術(shù)，在監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物的濃度和活力、對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑、細(xì)胞毒劑或其他試劑的劑量反應(yīng)或反映進(jìn)程中有著廣闊的應(yīng)用前景。
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