提速小麥單倍體技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程——原創(chuàng)小麥單倍體花青素標(biāo)記鑒別系統(tǒng)
日期:2023-03-08 17:31:35
小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一,為人類提供約20%的食物熱量。隨著全球人口的增加,2050年小麥產(chǎn)量需要提高70%,培育優(yōu)良品種是提高產(chǎn)量的有效途徑。然而,使用傳統(tǒng)方法非常耗時(shí),培育一個(gè)新的小麥品種通常需要至少8-10年。但通過雙單倍體(Doubled Haploid,DH)育種技術(shù)的運(yùn)用,純系只需1-2個(gè)世代即可產(chǎn)生,顯著縮短育種周期,大大加快了育種進(jìn)程。DH系生產(chǎn)包括3個(gè)環(huán)節(jié),即單倍體誘導(dǎo) 、單倍體加倍和DH系繁殖與鑒定,每個(gè)環(huán)節(jié)都對(duì)純系的生產(chǎn)效率至關(guān)重要。


在小麥單倍體誘導(dǎo)環(huán)節(jié),前期中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)團(tuán)隊(duì)研究團(tuán)隊(duì)通過敲除玉米單倍體誘導(dǎo)關(guān)鍵基因ZmPLA1的同源基因,率先在小麥中建立了單倍體誘導(dǎo)(haploid induction, HI) 技術(shù)體系,單倍體誘導(dǎo)效率高于20%。小麥單倍體技術(shù)體系雖有了高效的誘導(dǎo)技術(shù),但是該技術(shù)的應(yīng)用仍需解決小麥單倍體鑒別等問題,開發(fā)高效的標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)小麥單倍體鑒別(haploid identification, HID) 的核心。

2023年3月1日, Plant Communications在線發(fā)表了中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳紹江、劉晨旭團(tuán)隊(duì)題為“Establishment of an efficient haploid identification system by engineering anthocyanin accumulation in wheat embryo”,該研究利用玉米花青素調(diào)控基因ZmC1和ZmR,成功創(chuàng)制了小麥紫胚芽鞘誘導(dǎo)系PCI和紫胚誘導(dǎo)系PEI,實(shí)現(xiàn)了小麥單倍體的精準(zhǔn)鑒別,并利用PEI誘導(dǎo)系成功創(chuàng)制了DH系,展現(xiàn)了該技術(shù)在小麥育種中的應(yīng)用前景

前人研究表明ZmC1和ZmR可以調(diào)控植物花青素合成,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)為了測(cè)試使用ZmC1和ZmR進(jìn)行小麥HID的可行性,評(píng)估了轉(zhuǎn)基因品系A(chǔ)L-30和AL-40的色素沉著情況,這些品系分別含有pUbi驅(qū)動(dòng)的ZmC1和pUbi驅(qū)動(dòng)的ZmR。AL-30和AL-40在胚胎和種皮分別出現(xiàn)色素沉著(圖1A)。除此以外,在胚胎或胚乳中沒有發(fā)現(xiàn)AL-30、AL-40和野生型之間的差異。接下來,通過將AL-30和AL-40雜交,研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)造了一個(gè)同時(shí)具有ZmC1和ZmR的F1。結(jié)果表明,成熟的胚胎(ME),未成熟的胚胎(IE)和F1果核的外胚層都顯示出深紫色色素,表明ZmC1和ZmR能協(xié)同促進(jìn)花青素的積累(圖1A)。然而,ZmC1和ZmR的同時(shí)過表達(dá)也導(dǎo)致導(dǎo)致葉片強(qiáng)烈的色素沉著,嚴(yán)重阻礙了幼苗的生長(zhǎng),最終導(dǎo)致死亡。因此,不能簡(jiǎn)單地將pUbi驅(qū)動(dòng)的ZmC1和ZmR用于小麥的HID。

研究團(tuán)隊(duì)將組成型表達(dá)ZmC1的材料AL-30與誘導(dǎo)系進(jìn)行雜交,通過分子標(biāo)記與表型輔助選擇,育成了紫胚芽鞘誘導(dǎo)系PCI。利用該誘導(dǎo)系雜交的后代,根據(jù)胚芽鞘顏色可實(shí)現(xiàn)單倍體精準(zhǔn)鑒別(圖1B-C),單倍體鑒別準(zhǔn)確率為96.3%(圖1G-H)。

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圖1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)建立的高效小麥HID系統(tǒng)

為了在種子階段實(shí)現(xiàn)可視化的HID,研究團(tuán)隊(duì)確定了一個(gè)胚胎偏好的啟動(dòng)子Oleosin-like基因—TaOle。TaOle的1419bp啟動(dòng)子片段與ZmR和ZmC1的CDS融合,構(gòu)成pTaOle驅(qū)動(dòng)的ZmR-P2A-ZmC1表達(dá)載體(圖1D)。將該載體被轉(zhuǎn)化到小麥單倍體誘導(dǎo)系TaPLA-4A和TaPLA-4D中,結(jié)果表明所有四個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因植株在IE和ME中都顯示出深紫色的色素沉著,但在其他組織中沒有染色,表明pTaOle在轉(zhuǎn)基因植物的胚胎中工作良好(圖1E)。更重要的是,這些轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)和發(fā)育沒有受到影響,這是對(duì)AL-30和AL-40的F1雜種的巨大改良。在T1代中,具有ZmR-P2A-Zm純合基因型的個(gè)體被篩選并命名為紫色胚胎誘導(dǎo)系(PEI)。

為了測(cè)試HID的性能,我們用CS、JW1和MR-H的胚胎供體植物與花粉來自同源的T1 PEI植物的花粉雜交。根據(jù)IE和ME色素沉著的缺失情況,篩選出推測(cè)的單倍體(圖1F),并通過流式細(xì)胞儀和表型進(jìn)一步驗(yàn)證(圖1G)。在IE階段,有11個(gè)和9個(gè)推定的單倍體分別來自CS和JW1,后被驗(yàn)證為真正的單倍體;在ME階段,有2個(gè)、6個(gè)和3個(gè)假定的單倍體分別來自CS、JW1和MR-H。倍性分析的結(jié)果顯示分析結(jié)果顯示,只有MR-H的一個(gè)推定單倍體被發(fā)現(xiàn)是二倍體(6N)。為了進(jìn)一步評(píng)估HID的準(zhǔn)確性,在T2代中篩選了13個(gè)假定的CS單倍體,所有這些都被證實(shí)是真正的單倍體。因此,在IE和ME階段的總體HID準(zhǔn)確性為97.7%(圖1H)。同樣的方法用于驗(yàn)證18個(gè)假定的二倍體(6N)的紫色胚胎,所有這些胚胎都被確認(rèn)為真正的二倍體(6N)。上述結(jié)果表明,PEI可以實(shí)現(xiàn)小麥的高效HID。

此外,研究團(tuán)隊(duì)將F1雜交種(CS×Fielder)與PEI雜交,產(chǎn)生單倍體用于染色體加倍??偣搏@得11個(gè)單倍體,所有的單倍體在秋水仙素處理后都加倍了。為了研究DH是否在所有的染色體上都是純合的,用靶向測(cè)序技術(shù)對(duì)11個(gè)DH的基因組進(jìn)行了基因分型。9158個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的生物信息學(xué)分析顯示,沒有一個(gè)DH攜帶雜合的位點(diǎn)(圖1I),表明PEI可以誘導(dǎo)純合子,并可能成為小麥DH育種的一個(gè)前景廣闊的工具

該研究原創(chuàng)的小麥單倍體花青素標(biāo)記鑒別系統(tǒng),為新型小麥單倍體育種技術(shù)從理論研究到實(shí)踐應(yīng)用邁出了一大步,提速小麥單倍體技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程,對(duì)于加快小麥育種進(jìn)程具有里程碑式的意義。

綜上所述, DH育種因具備周期短、純度高等優(yōu)點(diǎn),獲得了國(guó)內(nèi)外各大農(nóng)業(yè)公司及育種單位的密切關(guān)注。對(duì)于種業(yè)公司來說,早日推出優(yōu)異新品種就可以早日獲取效益,而對(duì)于育種家們來說,縮短育種周期、加快育種速度是他們畢生的奮斗目標(biāo)。隨著單倍體誘導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)控基因的進(jìn)一步挖掘和基因編輯技術(shù)的聯(lián)合使用, DH育種技術(shù)已經(jīng)不僅僅局限在玉米純系的創(chuàng)制上,其應(yīng)用也由玉米拓展到單子葉作物水稻、小麥、谷子,以及雙子葉擬南芥、蒺藜苜蓿、番茄、煙草等多種植物上,未來 DH育種技術(shù)在作物育種和改良上將發(fā)揮更大的作用,糧食作物以及蔬菜經(jīng)濟(jì)作物工廠化應(yīng)用將很快到來。

—— 參考文獻(xiàn) ——

Qi X, Guo S, Zhong Y, et alEstablishment of an efficient haploid identification system by engineering anthocyanin accumulation in wheat embryo. Plant Communications, 2023, 100568.


實(shí)驗(yàn)室-溫室-田間的一體化DH生產(chǎn)服務(wù)
北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺(tái)。中心建立了基因克隆和載體平臺(tái)、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺(tái)、表型鑒定分析平臺(tái)、數(shù)據(jù)分析和利用平臺(tái)等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺(tái),是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺(tái)。

為了縮短您的育種進(jìn)程,提高您的育種成功率,北大荒墾豐種業(yè)澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心將為您提供一體化DH生產(chǎn)服務(wù)。我們提供DH服務(wù)技術(shù)流程:從實(shí)驗(yàn)室——溫室——田間一體化服務(wù)
1、單倍體產(chǎn)生
父本誘導(dǎo)系誘導(dǎo)母本材料,孤雌生殖,產(chǎn)生單倍體種子(幼胚)。
2、剝胚及培養(yǎng)
20-60份/皿。置于人工培養(yǎng)室(帶光照層架)或人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)左右。
3、挑選
將幼胚在體視熒光顯微鏡下觀察或者在日光燈下觀察,以自交系所得幼胚為對(duì)照。因?yàn)殡s合二倍體含有父本基因,所以單倍體有微弱熒光或無色。

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4、生苗
將挑選的擬單倍體直接置于含有加倍藥劑(秋水仙素)的MS培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng);后轉(zhuǎn)入不含加倍藥劑的MS培養(yǎng)基,暗培養(yǎng)后光照培養(yǎng),待幼苗2葉一心時(shí)移至培養(yǎng)瓶中(MS培養(yǎng)基)。

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5、煉苗
將培養(yǎng)瓶中DH系幼苗在4葉一心時(shí)移栽至苗缽,在溫室中煉苗。

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6、移栽
待幼苗5-6葉期移栽至溫室花盆或大田,待散粉時(shí),及時(shí)套袋進(jìn)行自交授粉。

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7、收獲
田間收獲和鑒別。如果用采用花藥離體培養(yǎng)單倍體的方法,則省去觀察幼胚的步驟,其余步驟基本相同。

花粉活力檢測(cè)分析服務(wù)
花粉作為一種重要的種質(zhì)資源,被廣泛利用到科學(xué)研究、新品繁育、農(nóng)業(yè)研究、種子生產(chǎn)等領(lǐng)域中。通常,花粉容易受到光照、溫度、濕度等環(huán)境因素的影響,因此花粉活力檢測(cè)是育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中必不可少的檢測(cè)指標(biāo)。篩選高活性的花粉進(jìn)行授粉可以提高作物結(jié)籽率、果品品質(zhì),提高產(chǎn)量預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,進(jìn)而減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中不必要的損失。傳統(tǒng)上進(jìn)行花粉活力檢測(cè)主要通過染色法和體外萌發(fā)法,然而這兩種方法費(fèi)時(shí)耗力、通量低、適用性及統(tǒng)計(jì)性差,往往不能滿足育種、生產(chǎn)過程中的日常需求。花粉活力分析儀通過檢測(cè)流經(jīng)交流電場(chǎng)的花粉顆粒的電阻抗特性,實(shí)時(shí)獲取大量花粉顆粒的大小、活性、濃度等數(shù)據(jù)。該方法已應(yīng)用于上百種植物花粉活性的檢測(cè),是一種高效、可靠且標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)技術(shù)。澤泉科技AgriPheno平臺(tái)已引進(jìn)Ampha? Z40花粉活力分析儀并向廣大育種家和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者推出花粉活力的檢測(cè)分析服務(wù)。
親本選育
DH育種是利用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)(或花藥離體培養(yǎng)等手段誘導(dǎo))產(chǎn)生單倍體植株,再通過染色體組加倍(自然加倍或藥劑處理)使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)的育種方法。由于自然單性生殖或孤雄生殖單倍體非常罕見,因此單倍體的獲得成為單倍體育種的一個(gè)難點(diǎn),游離小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的重要手段之一?;ǚ刍盍Ψ治鰞x(阻抗流式細(xì)胞技術(shù),IFC)可以在DH育種過程中,幫助選擇小孢子植物供體,評(píng)估小孢子胚誘導(dǎo)策略,優(yōu)化培養(yǎng)條件,并在小孢子培養(yǎng)早期進(jìn)行產(chǎn)胚量的準(zhǔn)確預(yù)測(cè),可顯著提高游離小孢子培養(yǎng)的成功率,進(jìn)而加快DH育種的效率。


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小麥孢子發(fā)育變化軌跡
親本選育
花粉的形成受到遺傳因素的嚴(yán)格控制,而當(dāng)控制花粉發(fā)育的基因發(fā)生突變時(shí)將導(dǎo)致花粉質(zhì)量降低、花粉數(shù)量減少或是完全沒有花粉。雜交育種過程中,花粉敗育的雄性不育系是理想的母本,而任意環(huán)境下具備大量高活性花粉的雄性可育系則是理想的父本。

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不同品種的蘋果花粉的活性(含熱滅活對(duì)照)
優(yōu)化花粉發(fā)育條件,篩選優(yōu)質(zhì)、高抗品種
花粉活性通常會(huì)受到光、熱溫度、農(nóng)藥等環(huán)境因素的影響,可以通過不同條件下花粉的活性來確定花粉生長(zhǎng)的理想條件,或篩選優(yōu)質(zhì)、高抗品系。下圖為五種不同植物花粉對(duì)溫度變化的響應(yīng),如圖所示,某些花粉是可以暴露在50℃的高溫下的(粉色),而其他花粉則在45℃就逐漸失活。這表明每一種花粉都有其理想的生長(zhǎng)溫度,獲得高活性花粉不能超過其理想生長(zhǎng)溫度。

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五種不同植物花粉對(duì)溫度變化的響應(yīng)
確定花粉采集時(shí)間、優(yōu)化花粉儲(chǔ)存條件
育種和生產(chǎn)過程中,通常會(huì)遇到花期不育的問題,這就需要提前采集花粉,保存?zhèn)溆?。但自然條件下,絕大多數(shù)植物花粉的壽命都較短,而且容易受溫度、光照等因素的影響,因此,何時(shí)收獲花粉,收獲后如何保存并維持花粉的活力則至關(guān)重要。

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未開放的花苞(左)和剛剛開放的花朵(中),花粉具備活性,當(dāng)花蕊完全伸展后(右),花粉則不再具備活性。

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不同儲(chǔ)存條件下花粉活性的變化
除花粉外的其他細(xì)胞
真菌孢子細(xì)胞與花粉粒具有高度相似性,因此也可以進(jìn)行類似的活性檢測(cè),目前已檢測(cè)過的細(xì)胞有細(xì)菌、酵母、藻類、動(dòng)物、人體等單細(xì)胞。下圖為不同來源的酵母活性的對(duì)比,如圖所示,鮮酵母活性較高;,而干燥酵母,即使于室溫下培育1小時(shí),它的活性仍然比新鮮酵母低;取自啤酒的酵母細(xì)胞活性較差。

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不同來源的酵母細(xì)胞活性對(duì)比
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