搭載多波長激發(fā)光源，調(diào)制模式具備完整的PAM功能，可測量PSⅡ功能性捕光截面Sigma(Ⅱ)

非調(diào)制泵浦探針技術，可監(jiān)測OEC狀態(tài)與衰減，周期-4-震蕩，類胡蘿卜素三重態(tài)能量弛豫

重要升級：

?  一臺儀器兩種功能：非調(diào)制超快閃光動力學分析和多激發(fā)波長調(diào)制(PAM)應用。新款MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ是一款緊湊型儀器，同時包含兩種截然不同的技術：單翻轉閃光動力學(STK)和PAM技術。

?  超快時間分辨率：一套完整的快速測量組合(時間分辨率低至0.3μs)，可以探測PSⅡ供體側放氧復合體Period-4震蕩和類胡蘿卜素三重態(tài)(Car-trip)的生成與能量弛豫，

?  多激發(fā)波長調(diào)制(PAM) 測量應用，可以探測PSⅡ受體側、電子傳遞鏈和光合作用光化學活性。

?  兩種技術組合使用：例如使用3 μs飽和閃光，通過PAM測量光監(jiān)測誘導熒光信號的衰減動力學。測量光頻率按對數(shù)遞減。

全新功能：

?  高時間分辨率：新的STK探測器提供0.3 μs的時間分辨率。

?  時間分辨閃光響應：MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ是第一款市售儀器，可以測量飽和 μs 閃光期間的熒光產(chǎn)量，并可以區(qū)分類胡蘿卜素三重態(tài)淬滅(TQ)和供體側依賴性淬滅(DQ)。

?  高精度：為了詳細分析閃光響應，它們的時間非常精確且可重現(xiàn)，閃光的形狀接近矩形，LED需要大約0.5μs才能達到完全強度。為閃光配置文件校正提供了一個特殊的例程。

?  極強的閃光：使用EDST發(fā)射器檢測器單元可以實現(xiàn)超過1000000 μmol 440 nm m^-2 s^-1的閃光強度(每μs產(chǎn)生超過1個激發(fā))。

?  泵浦探針：具有可變暗間隔 ?t(從1μs到10ms)的雙閃實驗，允許對各種形式的淬滅進行高度靈活的弛豫測量。

?  周期4振蕩：高達100Hz(10ms間隔)的閃光頻率可用于閃光序列，以探測放氧復合物的S狀態(tài)。

?  葉片測量：雖然該儀器最初是為懸浮液測量而設計的，但EDST發(fā)射器檢測器(STK-flashlamp)裝置也可以單獨用于測量植物葉片。此外，即將推出一種配置，其中兩個發(fā)射器相對于多波長發(fā)射器呈45° 角放置，這允許對葉片發(fā)出的熒光進行兩種波長的檢測。

?  PAM記錄中嵌入的STK：由于在快速非調(diào)制和PAM測量之間快速切換[8-10μs切換時間]，ST可以放置在傳統(tǒng)測量中的任何位置，例如O-I₁-I ₂-P或慢速動力學記錄，所得STK揭示了閃光時刻PS Ⅱ 狀態(tài)的詳細信息。所有這些結合在一起，使MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ成為一款非常全面的熒光計，允許用戶以多種不同的方式探測和監(jiān)測PS Ⅱ和光合電子傳遞鏈。

重要升級

?  在多激發(fā)波長(PAM)配置中，用戶可以測量與激發(fā)波長相關的有效PSⅡ天線尺寸信息：Sigma(Ⅱ)、PS Ⅱ受體側的反應(Q_A^-再氧化)和沿電子傳遞鏈的電子流(O-I₁-I₂-P/OJIP瞬變)，還可以進行飽和脈沖淬滅分析、誘導曲線和暗弛豫曲線， 以及光響應曲線，所有這些都適用于5種不同的激發(fā)和測量光波長(440、480、540、590、625 nm)以及可以任意組合應用的白光。這樣做的好處是，例如，使用硅藻作為研究對象的人可以在綠色中激發(fā)這些生物，在藍藻的情況下，可以選擇625 nm來激發(fā)藻膽體或440 nm來激發(fā)核心天線的葉綠素。

?  MULTI-COLOR-PAM-Ⅱ的高靈敏度允許使對薄的樣品進行測量，即在沒有光質和光強梯度的情況下測量樣品，在很大程度上避免了波長依賴性的熒光重吸收。

?  使用濾光片自由選擇檢測波長，例如，能夠檢測熒光λ>700 nm，富含PSI熒光F(I)和λ< 710 nm，富含PSⅡ熒光F(Ⅱ)，可以在相同條件下同時測量。

?  通過比較PAM和閃光動力學(STK)測量來表征給定樣品的相同狀態(tài)。

?  創(chuàng)建Trigger和Script文件可以進行自定義實驗程序測量，充分發(fā)揮用戶自主設計實驗的創(chuàng)造力。

應用概述：

配置選項：

1.       多激發(fā)波長配置：多波長激發(fā)單元(MCP-Ⅱ-E)及其檢測單元(MCP-Ⅱ-D1或MCP-Ⅱ-D2ST)

2.       雙波長檢測(PAM)配置(懸浮液)：需兩個檢測器(MCP-Ⅱ-D1和 MCP-Ⅱ-D2ST)得以允許同時檢測λ<710 nm(主要是PSⅡ)和λ>700 nm(PS Ⅱ+PS I)的熒光。允許兩個波長檢測的葉夾將在不久后推出。

3.       完整配置：STK閃光燈(最大閃光強度> 1.0 mol m^-2 s^-1)和組合檢測器(MCP-Ⅱ-EDST+MCP-Ⅱ-D2ST)，允許檢測低至約100 ns的信號，添加到多波長(PAM)配置中。這允許訪問PSⅡ供體副反應。

4.       用于懸浮液測量的單翻轉動力學(STK)配置：STK閃光燈(MCP-Ⅱ-EDST)與組合檢測器(MCP-Ⅱ-D2ST)組合。

5.       用于葉片測量的單周轉動力學(STK)配置：STK閃光燈作為獨立應用：STK閃光燈包含一個用于從樣品表面進行熒光測量的檢測器，這使其成為測量樹葉的理想選擇。

PamWin-4 軟件

基本功能和圖形用戶界面：PamWin-4是控制MULTI-COLOR-PAM(-II)和PAM-2500的軟件，由PamWin-3發(fā)展而來，可以處理 MULTI-COLOR-PAM-II的所有新功能。該軟件可在Windows 10（32位和64位）和11操作系統(tǒng)的個人電腦上運行。軟件由3部分組成： SP分析、用于PAM應用的快速采集（前3個標簽）和用于非調(diào)制閃光分析的單周轉動力學 (STK)測量（后2個標簽）。

廣泛的應用組合也意味著可以在選項卡上定義大量特定應用的部分設置。在新的“ST設置”選項卡上，不僅可以定義單次、兩次或多次閃光實驗（如下圖第一個示例），還可以定義用于確定周期-4 振蕩的閃光序列（帶或不帶預閃），如下圖第二個示例所示。

簡單設置即可定義帶或不帶預閃的閃光實驗和閃光序列。

用戶可以通過一個簡單的菜單定義單閃或雙閃（或多閃）實驗。后者對于配置泵浦探針測量尤為重要。通過脈沖系列菜單，可以定義閃光燈組。

將“目標編號”設為14，將應用14次閃光（在此情況下，間隔為200ms）。

通過兩次預閃光（此處間隔100ms），可以誘導S3狀態(tài)。通過改變預閃光和閃光組之間的延遲時間（此處為1秒），可以監(jiān)測S3狀態(tài)的衰減。

分析周期-4振蕩的工具是軟件的一部分（見應用）。

對于快速采集數(shù)據(jù)，軟件提供兩種支持。一方面是Trigger文件和Script形式的測量協(xié)議，另一方面是用于分析O-I1瞬變的擬合例程，以確定捕光天線橫截面Sigma(Ⅱ)、單周轉閃光后或照明一段時間后的指數(shù)熒光衰減。

軟件附帶的Script和Trigger文件也可用作示例，在此基礎上開發(fā)其他腳本和觸發(fā)器文件。

300 ms多相上升的Trigger文件，1ms后有一次單周轉閃光。

在Trigger運行的情況下，Trigger文件中定義的實驗協(xié)議將根據(jù)常規(guī)設置頁面中的設置執(zhí)行。

在Script文件的情況下，一個或多個觸發(fā)文件被嵌入時間軸，同時定義實驗不同部分的時間。在腳本中，用戶還可以定義所用不同光源的強度和/或波長；這些設置可以根據(jù)腳本時間軸的進程進行更改。下面是一個Sigma(Ⅱ)測定的腳本文件示例，例如可以一次性測量五個不同激發(fā)波長的捕光天線截面。

應用實例

來自三個應用領域的示例實驗

該軟件將MULTI-COLOR-PAM-II的應用程序分為3個部分：

1.       光合活性相關的應用，如誘導曲線，誘導+暗弛豫曲線和光曲線自動程序，或手動測量。

2.       基于腳本的應用，如O-I₁-I₂-P/OJIP瞬變、單周轉閃光后Q_A^-的再氧化動力學、Sigma(II)測定。

3.       基于ST閃光的實驗，如周期4振蕩、類胡蘿卜素三重態(tài)誘導和衰減動力學，P680⁺

前兩部分代表PAM應用，最后一部分代表單周轉動力學(STK)應用。

光曲線/淬滅分析

上圖是測量PS II互補量子產(chǎn)率Y(II)+Y(NPQ)+Y(NO)=1的光曲線示例。由于記憶效應，光強減弱時誘導的動力學可能與光強增強時不同。這種現(xiàn)象被稱為滯后。這里觀察到的光誘導Y(II)降低和Y(NPQ)升高的完全可逆性是生理健康樣品的特征。

測量快速動力學(PAM)

通過兩個不同波長測量的O-I₁-I₂-P瞬變

PAM快相應用的一個例子是同時測量兩個不同波長的O-I₁-I₂-P瞬變：在波長<710 nm處測得的熒光主要是PSⅡ熒光，而>700 n處的熒光則是PSⅡ和PSI熒光的混合熒光。該結果是由Klughammer等人(2024年)對小球藻細胞稀釋懸浮液(440nm ML和MT)的測量首次發(fā)現(xiàn)的。

兩種波長的O-I₁上升(曲線歸一化為I₁)相同。I₂和P之間存在差異：與F<710nm相比，在 F>700nm時，I₂-P上升更明顯。

下圖是使用雙波長葉片配置（請參閱“配置”），通過440 nm測量光和光化光測量大麥葉片的結果。

這兩項測量結果再次歸一化為I₁(所有Q_A均已還原)。同樣，與F<710nm相比，F>700nm處的I₂-P上升更為明顯。O-I₁的上升動力學稍慢，這反映出 F<710nm波長處的自吸收比F>700nm波長處高，因此F>700nm波長處來自葉片相對較深的層，那里的有效輻射光強度較低。

功能性捕光截面Sigma(Ⅱ) 測量

參數(shù)Sigma(II)反映了PSⅡ捕光天線的有效截面。Sigma(Ⅱ)的測定（及其波長依賴性）是另一種PAM快速動力學測量的應用。有三個標準可以用來判斷用于 Sigma(Ⅱ)測定的O-I₁擬合是否良好：1. 擬合應能很好地描述熒光的上升；2. 得到的擬合參數(shù)應與生理相關；3. 獲得的Sigma(Ⅱ)值應與光照強度無關。在這里，觀察到Sigma(Ⅱ)值隨著所用培養(yǎng)物的階段而增加。

在這個實驗中，連通性參數(shù)J被固定為1.2，這是Anne和Pierre Joliot在1964年獲得的值。該數(shù)據(jù)集顯示了近乎完美的擬合、合理的參數(shù)值，本質上是高光強度下光強度的獨立性，產(chǎn)生了定義明確的 O-I₁ 動力學。

單周轉閃動力學STK應用

類胡蘿卜素三重態(tài)衰減

下圖顯示了一組測量值，根據(jù)這些測量值可以確定類胡蘿卜素三重態(tài)衰變動力學。該數(shù)據(jù)集說明了閃光時間的精度，以及閃光燈提供兩次相隔1μs的相同強度閃光的能力。

閃光長度和熒光誘導

另一個案例是雙閃實驗，其中第一次閃光的長度是變化的，第二次閃光是在第一次閃光40微秒后進行的。

閃光序列和閃光模式可以告訴我們一些有關S態(tài)的信息，即供體側錳簇的氧化還原態(tài)。它們還能告訴我們不同強度的遠紅外光的影響。

周期-4 振蕩

軟件可自動得出 Fo、Fm 或 Fv水平的周期-4 振蕩(圖摘自Klughammer等人，2024年)。

在咖啡葉片中，FR1照明已導致可變熒光中的周期-4 振蕩受到強烈抑制。在這種情況下，MULTI-COLOR-PAM-II可以將有效的FR強度進一步降低到FR1的10%，這就大大降低了對咖啡葉S態(tài)的影響。

STK和 PAM組合測量

下一個案例展示了如何通過STK和PAM測量光的組合，將精確、高強度和短時間的STK和PAM測量光結合起來，以監(jiān)測黑暗中的熒光衰減。

在PAM測量中，對受DCMU抑制(藍色)或未受抑制(紅色)的稀釋小球藻樣本施加3 μs STK閃光。從閃光后100 μs開始，ML頻率從100 kHz對數(shù)下降到10 kHz（圖摘自Klughammer等人，2024年）。

產(chǎn)地：德國WALZ

參考文獻(MULTI-COLOR-PAM-II)

1.       Klughammer, C., Schlosser, F. & Schreiber, U. Flash-kinetics as a complementary analytical tool in PAM fluorimetry. Photosynth Res 161, 151–176 (2024). https://doi.org/10.1007/s11120-024-01101-w

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