單倍體育種作為育種的核心生物技術(shù)之一,具有快速純合基因、縮短育種年限、提高育種效率等優(yōu)勢(shì)。這項(xiàng)技術(shù)是基于對(duì)處于發(fā)育特定階段的小孢子在進(jìn)行脅迫處理,可使小孢子的配子體途徑發(fā)生重編程轉(zhuǎn)向孢子體途徑,從而產(chǎn)生胚胎。在整個(gè)發(fā)育過程中,雄配子體誘導(dǎo)的產(chǎn)胚率受許多因素的影響,如供體植株的質(zhì)量和生理狀態(tài)、自身基因型、小孢子發(fā)育階段、脅迫誘導(dǎo)預(yù)處理和培養(yǎng)條件等,因此如何提高雄配子體誘導(dǎo)的產(chǎn)胚率是這項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵。
在過去十年中,研究者通常利用染色法和顯微鏡鏡檢來研究小孢子胚性發(fā)育并進(jìn)行產(chǎn)胚量的預(yù)測(cè),由于染色法不具備通用性,不同的物種需要選擇不同的染色劑,導(dǎo)致整個(gè)測(cè)試過程繁瑣且費(fèi)時(shí)、耗力。因此,亟需一種可以簡單、快速、可靠檢測(cè)小孢子胚性發(fā)育階段的無創(chuàng)檢測(cè)工具。有研究報(bào)道,Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC)基于細(xì)胞介電特性可檢測(cè)細(xì)胞的大小及活性,已應(yīng)用于細(xì)菌活性、酵母大小,腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡和壞死等多項(xiàng)研究中。本研究利用Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC),進(jìn)行了:(i)離體培養(yǎng)細(xì)胞活力的常規(guī)監(jiān)測(cè);(ii)脅迫處理效率的測(cè)定;(iii)小孢子懸浮液中產(chǎn)胚量的早期預(yù)測(cè),探討了小麥小孢子離體培養(yǎng)過程中發(fā)生不同發(fā)育途徑的可能性。研究表明,IFC技術(shù)可以很好的描述細(xì)胞懸浮液中所有小孢子的發(fā)育途徑,包括胚性小孢子和花粉小孢子,可以簡單快速準(zhǔn)確的評(píng)估脅迫處理的效率,并在小麥雄核發(fā)育的早期(離體培養(yǎng)的前7天內(nèi))進(jìn)行產(chǎn)胚量的可靠預(yù)測(cè)。圖1 IFC法判別小孢子懸浮液(培養(yǎng)1天)中活細(xì)胞和死細(xì)胞
(A)為熱處理后小孢子懸浮液散點(diǎn)圖;(B)為未處理小孢子懸浮液散點(diǎn)圖;振幅代表細(xì)胞大小,相位角代表細(xì)胞活性;(C)為IFC法與染色法相關(guān)性比較(P<5;=0.9922,n=15)
圖2 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段(IFC法)配子體途徑:ML:單核中晚期;EB:早期雙核;LB:單核晚期;ET:三核早期;LT:三核晚期。孢子體途徑:顯示了培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0、1、5和7天的小孢子發(fā)育狀態(tài)。ML/D-21代表配子體發(fā)育和孢子體發(fā)育的共同階段,紅色垂直門控右側(cè)為活性細(xì)胞,藍(lán)色多邊形門控P1為雄核發(fā)育開始時(shí)的活性孢子群;綠色多邊形門控P2為孢子離體培養(yǎng)前(D0)的活性孢子群;紫色多邊形門控P3為離體培養(yǎng)1天后的活性孢子群。P1、P2、P3三個(gè)孢子群精準(zhǔn)描繪出雄核發(fā)育過程的三個(gè)階段。圖3 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段(顯微鏡)熒光DAPI染色后,使用可見光顯微鏡觀察小孢子:(A)單核小孢子;(B)雙核小孢子;(C)花粉粒;(D)星形小孢子(v為液泡);(E)多核小孢子;(F)質(zhì)膜化小孢子。比例尺=20μm。圖4 P1、P2、P3三個(gè)小孢子類群的振幅和相位角中值數(shù)本次實(shí)驗(yàn)分別在培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0天和第5天用IFC法檢測(cè)了不少于5個(gè)小孢子懸浮液,并分別分析了每個(gè)懸浮液中P1、P2和P3類群中小孢子的活性(振幅A圖)和大?。ㄏ辔唤荁圖)。每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)類群內(nèi)小孢子的數(shù)量。Tukey檢驗(yàn)表明,不同培養(yǎng)天數(shù)下,不同類群內(nèi)的孢子數(shù)量沒有顯著變化(p<0.05),進(jìn)而說明IFC法可以精準(zhǔn)描繪出雄核發(fā)育過程。圖7 Pavon小麥小孢子培養(yǎng)早期的產(chǎn)胚量預(yù)測(cè)(IFC法)本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)第7天的小孢子懸浮液中P3類群的小孢子的存活率并與產(chǎn)胚量進(jìn)行了相關(guān)性分析,所得線性方程為:y=6.539x-20.827;=0.9519,p<0.05 。結(jié)果表明,IFC法可以在小孢子培養(yǎng)早期進(jìn)行產(chǎn)胚量的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。綜上所述,Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀(IFC)是一個(gè)能夠簡單快速追蹤小孢子的發(fā)育狀態(tài)、評(píng)價(jià)脅迫處理效率、進(jìn)行產(chǎn)胚量早期預(yù)測(cè)的可靠測(cè)量工具。
案例介紹視頻:Customer Success Story: Embryo Yield Prediction in Microspore Culture,密碼: 0?5cD+fe
Canonge J, Philippot M, Leblanc C, et al. Impedance flow cytometry allows the early prediction of embryo yields in wheat (Triticum aestivum L.) microspore cultures. Plant Science, 2020, 300: 110586.