這是通訊作者單位完全來(lái)自國(guó)內(nèi)的首篇四通道動(dòng)態(tài)LED陣列近紅外光譜儀DUAL-KLAS-NIR應(yīng)用文獻(xiàn)。
光合作用是植物和藻類將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的核心過(guò)程，但其效率受限于動(dòng)態(tài)光環(huán)境的影響。在高光強(qiáng)下，光系統(tǒng)II(PSII)到光系統(tǒng)I(PSI)的電子傳遞鏈(ETC)易產(chǎn)生電子堆積，導(dǎo)致活性氧(ROS)生成，進(jìn)而損傷光合機(jī)構(gòu)(如PSII核心蛋白D1、RuBisCO等)。為應(yīng)對(duì)高光脅迫，植物和藻類進(jìn)化出了短期保護(hù)機(jī)制(如非光化學(xué)淬滅NPQ)和長(zhǎng)期適應(yīng)策略(如調(diào)整光系統(tǒng)復(fù)合體的比例)。然而，質(zhì)體藍(lán)素(Plastocyanin, PC)作為類囊體腔內(nèi)的可溶性電子載體，其在高光適應(yīng)中的作用尚不明確。
質(zhì)體藍(lán)素PC位于細(xì)胞色素b6f復(fù)合體(Cytb6f)與PSI之間，參與線性電子流(LEF)和環(huán)式電子流(CEF)。此前研究表明，PC水平與光合電子傳遞(PET)效率相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制仍不清楚。例如，擬南芥中PC過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)植物生長(zhǎng)和抗逆性，但其對(duì)光合碳固定和高光耐受的具體作用仍需深入探究。
2025年3月21日，Communications Biology在線發(fā)表深圳大學(xué)李曉政&胡章立教授團(tuán)隊(duì)，中科院植物所楊文強(qiáng)研究員課題組合作完成的，標(biāo)題為“Plastocyanin affects photosynthesis and high light acclimation by modulating redox states of electron transport chain in Chlamydomonas reinhardtii”的研究論文。本研究以模式綠藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建PC過(guò)表達(dá)(OEPC)和敲低(pckd)株系，系統(tǒng)解析質(zhì)體藍(lán)素PC通過(guò)調(diào)節(jié)電子傳遞鏈(ETC)氧化還原狀態(tài)影響光合效率和高光適應(yīng)的分子機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)材料：萊茵衣藻野生型株系為CC849(自有)和CC5352(美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)衣藻資源中心)，過(guò)表達(dá)株系OEPC以及敲低株系pckd。
光合活性測(cè)量：使用雙通道葉綠素?zé)晒鈨xDUAL-PAM-100測(cè)量樣品(2 mL,30 μg Chl)的PSII實(shí)際量子產(chǎn)率(Y(II))、電子傳遞速率(ETR(II))及非光化學(xué)淬滅(NPQ)。通過(guò)QA還原水平間接評(píng)估PQ庫(kù)還原狀態(tài)。通過(guò)DUAL-PAM-100近紅外差示吸收分析P700氧化狀態(tài)(Pm, Pm', P700ox, Y(I), Y(ND), Y(NA))及環(huán)式電子傳遞(CEF)活性。通過(guò)JTS-10光譜儀分析P700、Cytf和PC氧化還原狀態(tài)；通過(guò)四通道動(dòng)態(tài)LED陣列近紅外光譜儀DUAL-KLAS-NIR測(cè)量PC、Fd和P700的氧化還原吸收光譜。通過(guò)氧電極法測(cè)量暗適應(yīng)(5min)細(xì)胞在200 μmol m?2 s?1光強(qiáng)下照射5分鐘的氧氣釋放速率。
除此之外，本研究還進(jìn)行了藻株生長(zhǎng)速率曲線和總?cè)~綠素相關(guān)的生長(zhǎng)測(cè)量，超氧陰離子(O2?)生成相關(guān)的ROS檢測(cè)，免疫印跡分析，透射電鏡(TEM)觀察類囊體膜結(jié)構(gòu)及淀粉顆粒含量，RuBisCO和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性測(cè)量。過(guò)表達(dá)OEPC株系與野生型株系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較的基因表達(dá)差異。
研究人員首先對(duì)PC過(guò)表達(dá)株系的生長(zhǎng)特征進(jìn)行了研究。生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)分析顯示過(guò)表達(dá)株系OEPC在固體和液體培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出更快的生長(zhǎng)速率(圖1C、D)，且在400 μmol m?2 s?1高光下無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制，而野生型株系(CC849)則生長(zhǎng)顯著延遲(圖6A)。
圖1 不同PC水平的C. reinhardtii表型。
光合效率提升方面，過(guò)表達(dá)OEPC株系的放氧速率較野生型提高33%(圖1E)。葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)顯示OEPC過(guò)表達(dá)株系的PSII實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)率Y(II)和相對(duì)電子傳遞速率ETR(II)都高于野生型CC849(圖2A、C)，而pckd中則低于CC5325(圖 2B，D)。光曲線測(cè)量NPQ的結(jié)果顯示，OEPC株系的Y(NPQ)明顯高于野生型CC849，而在pckd中僅略高于CC5325(圖 2E，F(xiàn))。誘導(dǎo)曲線+暗弛豫的測(cè)量結(jié)果顯示OEPC的NPQ在光照的前100秒內(nèi)達(dá)到0.8的較高水平，然后相對(duì)穩(wěn)定地保持在0.7和0.8之間。CC849的NPQ最初上升到0.6的較低水平，然后下降到0.4，隨后上升到1.0的最高水平(圖2G)。而CC5325 的NPQ在100秒時(shí)先達(dá)到0.6，然后下降到0.3，隨后恢復(fù)到0.7并保持相對(duì)穩(wěn)定(圖2H)。P700近紅外差示吸收測(cè)量PSI氧化還原和電子傳遞的結(jié)果顯示，OEPC的ETR(I)比CC849高48%，而pckd比CC5325低17%(圖2J)。根據(jù)受體側(cè)限制Y(NA)的評(píng)估，OEPC中較大的ETR(I)并沒(méi)有對(duì)PSI受體產(chǎn)生很大的還原壓力。相反，在OEPC中觀察到的Y(NA)低于CC849，而在pckd中檢測(cè)到的Y(NA)高于CC5325(圖2I)。此外，OEPC的供體側(cè)限制Y(ND)比CC849大，而pckd和CC5325的Y(ND) 沒(méi)有明顯差異。因此，Y(I)在OEPC中增加，而在pckd中減少。
圖2 PSII和PSI的光合參數(shù)。
免疫印跡分析表明，與野生型相比，OEPC中LHCSR3蛋白含量明顯降低，而pckd中則有所增加(圖S4)。此外，與野生型相比，LHCSR3.1和LHCSR3.2的基因表達(dá)水平在OEPC 中降低，而在pckd中上調(diào)(圖S3)。
補(bǔ)充圖S3 過(guò)表達(dá)和野生型株系中捕光天線復(fù)合體蛋白基因的表達(dá)水平。補(bǔ)充圖S4 CC849、OEPCs、CC5325和pckd株系中LHCSR3蛋白水平的變化。
進(jìn)一步研究PC調(diào)控ETC氧化還原狀態(tài)的相關(guān)結(jié)果表明，PQ庫(kù)還原水平降低，OEPC中QA的還原程度低于野生型(圖3A)，表明PC過(guò)表達(dá)減少了PQ池的過(guò)度還原。DUAL-KLAS-NIR分析顯示PC氧化水平升高，OEPC中PC的氧化比例(PC?)顯著增加(表2)，尤其在800 μmol m?2 s?1下，PC氧化比例達(dá)69%(野生型為56%)。此外，過(guò)表達(dá)株系OEPC中Fd的還原程度降低(圖3G、I、K)，可能與碳同化增強(qiáng)有關(guān)。
圖3 ETC組分的氧化還原狀態(tài)及ROS產(chǎn)生。
補(bǔ)充圖S6 P700、Fd和PC差分模型圖(DMP)原始數(shù)據(jù)。(A)P700差分模型圖是通過(guò)每20s施加一次的多周轉(zhuǎn)閃光脈沖(光強(qiáng)13000 μmol m?2 s?1，持續(xù)時(shí)間50ms)測(cè)量，并對(duì)25次測(cè)量進(jìn)行平均后得到的； (B) Fd差分模型圖是通過(guò)600 ms光照(1350 μmol m?2 s?1)和30s的黑暗間隔測(cè)量，并對(duì)20次測(cè)量進(jìn)行平均后得到的；(C) PC差分模型圖使用KLAS軟件自帶的默認(rèn)協(xié)議進(jìn)行測(cè)量。
類囊體結(jié)構(gòu)緊密性分析的TEM觀察結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)株系OEPC的類囊體膜堆疊比 野生型CC849 更緊密，而pckd表現(xiàn)出比CC5325更松散的膜結(jié)構(gòu)。淀粉顆粒含量方面，OEPC細(xì)胞的淀粉含量顯著低于CC849，而pckd細(xì)胞的淀粉水平高于CC5325(圖4B)。
圖4 透射電鏡(TEM)下的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
ROS生成與碳代謝方面的研究結(jié)果顯示，ROS水平降低，NBT染色顯示，OEPC在高光下產(chǎn)生的超氧陰離子顯著少于野生型(圖3M)。碳固定增強(qiáng)：RuBisCO活性在OEPC中顯著升高(圖5B)，且CBB循環(huán)相關(guān)基因(如RBCS、GAP3)表達(dá)上調(diào)。淀粉合成抑制：AGPase活性下降(圖5C)，細(xì)胞淀粉含量減少，可能與Fd還原水平降低導(dǎo)致的Fd-TRX系統(tǒng)活性下降有關(guān)。
圖5 卡爾文循環(huán)和淀粉合成相關(guān)基因與酶活。
進(jìn)一步的研究評(píng)估了高光適應(yīng)中的PC動(dòng)態(tài)積累。PC誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，野生型CC849在高光(400 μmol m?2 s?1)下培養(yǎng)4天后，PC含量顯著積累(圖6E)，同時(shí)QA還原水平逐漸下降(圖6F)。光系統(tǒng)II修復(fù)增強(qiáng)：OEPC的PSII最大量子效率(Fv/Fm)在高光下保持穩(wěn)定，而野生型需數(shù)天恢復(fù)(圖6I)。
圖6 高光耐受性與PC積累的動(dòng)態(tài)關(guān)系。
基于上述研究總結(jié)出PC調(diào)控光合作用的分子機(jī)制模型。PC作為氧化還原電容器通過(guò)緩沖電子流，維持PQ和Fd的低還原狀態(tài)，減少ROS生成(圖7B)。此外，降低的Fd還原水平抑制淀粉合成，促進(jìn)碳流向生長(zhǎng)相關(guān)代謝，實(shí)現(xiàn)碳分配優(yōu)化(圖7B)。
PC通過(guò)調(diào)節(jié)ETC氧化還原狀態(tài)增強(qiáng)光合效率：PC過(guò)表達(dá)增加了PC池的氧化能力(PC?比例升高)，加速了PQH2在Cytb6f復(fù)合體的氧化，從而維持PQ池的低還原狀態(tài)。這緩解了PSII供體側(cè)的電子堆積，減少了ROS生成(如超氧陰離子)，并促進(jìn)LEF和ATP合成。此外，F(xiàn)d還原水平的降低可能通過(guò)抑制Fd-TRX系統(tǒng)，減少淀粉合成，使更多碳流向CBB循環(huán)，增強(qiáng)CO2固定(圖5B)。
PC在高光適應(yīng)中的雙重作用：短期高光脅迫下，PC通過(guò)增強(qiáng)ΔpH(跨膜質(zhì)子梯度)提高qE型NPQ，快速耗散多余光能(圖2E)。長(zhǎng)期高光暴露則誘導(dǎo)PC積累，通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控(如LHCB基因上調(diào))優(yōu)化光能捕獲，并維持PSII修復(fù)能力(圖6I)。這種動(dòng)態(tài)調(diào)控使藻細(xì)胞在高光下實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)與光保護(hù)的平衡。
PC與碳代謝的偶聯(lián)：淀粉含量減少是OEPC的顯著特征(圖4)。作者提出，低Fd還原水平抑制了AGPase活性，而CBB循環(huán)的增強(qiáng)進(jìn)一步將碳通量導(dǎo)向生物量合成而非儲(chǔ)存。這種代謝重編程可能在自然環(huán)境中幫助藻類適應(yīng)光強(qiáng)波動(dòng)，避免碳儲(chǔ)存過(guò)量對(duì)生長(zhǎng)的反饋抑制。
PC調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)：轉(zhuǎn)錄組分析顯示，PC過(guò)表達(dá)導(dǎo)致光合天線蛋白、CBB循環(huán)及葉綠素代謝相關(guān)基因顯著上調(diào)。例如，LHCB家族基因的表達(dá)增加可能增強(qiáng)了光捕獲能力，而RBCS和GAP3的上調(diào)直接促進(jìn)碳固定。這些變化共同構(gòu)成了PC介導(dǎo)的光合優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)。
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