DUAL-KLAS-NIR│酶活性的代謝物水平調(diào)控控制著藍(lán)藻從代謝休眠中的蘇醒
日期:2024-12-04 16:41:00

2024年12月2日,德國(guó)圖賓根大學(xué)Sofía Doello等人在Current Biology (IF=8.1)雜志在線(xiàn)發(fā)表題為Metabolite-level regulation of enzymatic activity controls awakening of cyanobacteria from metabolic dormancy的研究論文,文章研究了藍(lán)藻葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的調(diào)控機(jī)制,發(fā)現(xiàn)G6PDH的不活化主要是由于抑制性代謝物(如ATP、檸檬酸和草酰乙酸)的積累。此外,本研究的發(fā)現(xiàn)還表明,代謝物水平的調(diào)控是藍(lán)藻休眠蘇醒程序背后的驅(qū)動(dòng)力。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了代謝物水平調(diào)控在確??焖俸途_的酶控制中的關(guān)鍵重要性,使微生物能夠迅速適應(yīng)環(huán)境變化并經(jīng)歷發(fā)育轉(zhuǎn)變。

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研究背景

自然界中的微生物時(shí)常面臨各種不利于生長(zhǎng)的環(huán)境脅迫,許多細(xì)菌通過(guò)進(jìn)入休眠狀態(tài)來(lái)應(yīng)對(duì)這些狀況。事實(shí)上,代謝休眠在細(xì)菌中非常普遍,大多數(shù)自然環(huán)境中的微生物處于休眠而非生長(zhǎng)狀態(tài)。單細(xì)胞藍(lán)藻在營(yíng)養(yǎng)限制下進(jìn)入代謝休眠。特別是,藍(lán)藻系Synechocystis sp. PCC 6803(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Synechocystis)在氮耗竭期間的適應(yīng)性,已成為研究細(xì)菌休眠的模型。當(dāng)這種生物遭遇氮饑餓時(shí),細(xì)胞會(huì)降解光合器官和大多數(shù)細(xì)胞組分,并以糖原的形式積累碳。這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為黃化,因?yàn)樯亟到夂笥^察到的漂白過(guò)程。一旦這些改變發(fā)生,細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài),新陳代謝降至最低。

黃化細(xì)胞在氮補(bǔ)充之前保持靜止?fàn)顟B(tài),直到氮補(bǔ)充后才啟動(dòng)蘇醒程序。該程序依賴(lài)于糖原儲(chǔ)備的降解,作為能量和代謝物的來(lái)源,以恢復(fù)之前降解的所有細(xì)胞組分。先前的研究表明,糖原分解酶在黃化開(kāi)始時(shí)產(chǎn)生,與糖原合成同時(shí)發(fā)生。因此,它們必須保持不活躍狀態(tài),直到氮變得可用并且需要糖原降解時(shí)才活化。我們已經(jīng)證明,在氮饑餓期間嚴(yán)格控制糖原分解酶對(duì)生存至關(guān)重要,過(guò)早降解糖原儲(chǔ)備會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)催化葡萄糖-6-磷酸氧化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯。這一反應(yīng)代表了氧化磷酸戊糖 (OPP)途徑的第一步,這是所有生物體中存在的代謝途徑,為細(xì)胞提供以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和戊糖形式的還原能量。在光合生物中,G6PDH還是OPP旁路的一部分,在碳固定期間補(bǔ)充Calvin-Benson-Bassham(CBB)循環(huán)的代謝物中起著重要作用。由于OPP途徑和CBB循環(huán)之間存在共同反應(yīng),G6PDH在光合生物中通過(guò)氧化還原調(diào)節(jié),以防止碳固定和分解同時(shí)發(fā)生。

在藍(lán)藻中,唯一能夠進(jìn)行氧氣光合作用的原核生物,通過(guò)氧化磷酸戊糖循環(huán)蛋白(OpcA)實(shí)現(xiàn)G6PDH的氧化還原調(diào)節(jié)。在白天,當(dāng)光合電子傳遞和CBB循環(huán)運(yùn)行時(shí),OpcA主要由硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)保持在還原狀態(tài),該系統(tǒng)從鐵氧還蛋白(Fd)庫(kù)接收電子。在這種情況下,不需要OPP途徑的功能,OpcA以其還原形式抑制G6PDH,只留下維持OPP旁路運(yùn)行所需的殘余活性。在夜間,在沒(méi)有光合電子傳遞的情況下,細(xì)胞降解其糖原儲(chǔ)備以獲取能量。在這些條件下,Trx系統(tǒng)不被Fd還原,OpcA主要處于氧化狀態(tài)。OpcA中分子內(nèi)二硫鍵的形成導(dǎo)致G6PDH的底物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生構(gòu)象變化,增加其對(duì)葡萄糖-6-磷酸的親和力并激活酶。因此,OpcA允許在晝夜循環(huán)中嚴(yán)格控制G6PDH。然而,在代謝靜止條件下,OPP途徑的通量是如何控制的,這一點(diǎn)尚不清楚。在本研究中,Sofía Doello等人調(diào)查了黃化細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和代謝組,以及這些條件對(duì)糖原代謝和蘇醒過(guò)程的調(diào)節(jié)效應(yīng)。

本研究中,藍(lán)藻P700、鐵氧還蛋白Fd和NAD(P)氧化/還原的測(cè)定通過(guò)四通道動(dòng)態(tài)LED陣列近紅外光譜儀完成。

部分研究結(jié)果

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圖1 黃化細(xì)胞的代謝和氧化還原狀態(tài)。

(A) 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和氮饑餓期間G6PDH和6-磷酸葡萄糖的豐度。(B) Synechocystis電子傳遞鏈。(C) 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和黃化細(xì)胞中P700反應(yīng)中心、質(zhì)體藍(lán)素(PC)、鐵氧還蛋白(Fd)和NAD(P)H的熒光。細(xì)胞暗適應(yīng)后開(kāi)始測(cè)量。黃色和灰色虛線(xiàn)分別表示開(kāi)燈和關(guān)燈的時(shí)間。黑色五角星表示光照期間P700的瞬時(shí)還原階段。黑色菱形表示關(guān)燈后P700的緩慢還原階段。

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圖2 代謝物對(duì)G6PDH活性的篩選。
(A) OpcA存在下進(jìn)行篩選。(B)不存在OpcA下進(jìn)行篩選。粉色條表示抑制超過(guò)30%。藍(lán)色條表示激活超過(guò)30%。使用10 mM6-磷酸葡萄糖和2 mM NADP+作為底物進(jìn)行活性測(cè)量。按照?qǐng)D例中指定的濃度添加效應(yīng)物。

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圖3 存在和不存在OpcA時(shí)的情況下代謝物對(duì)G6PDH活性的影響。

(A)ATP,(B)檸檬酸,(C)草酰乙酸,(D)谷氨酰胺和(E) 3-磷酸甘油醛。左列顯示了在飽和底物濃度(10 mM6-磷酸葡萄糖)和Km濃度(OpcA存在時(shí)0.5 mM6-磷酸葡萄糖,OpcA不存在時(shí)5 mM 6-磷酸葡萄糖)下相應(yīng)代謝物的滴定。右列顯示了在選定濃度下相應(yīng)代謝物對(duì)酶動(dòng)力學(xué)的影響。

表1 代謝物處理下G6PDH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

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圖4 代謝物-蛋白質(zhì)相互作用的預(yù)測(cè)。
(A)帶有NADPH的G6PDH-OpcA復(fù)合物。(B)帶有6-磷酸葡萄糖的G6PDH-OpcA復(fù)合物。(C)帶有檸檬酸的G6PDH-OpcA復(fù)合物。(D)帶有ATP的G6PDH-OpcA復(fù)合物。(E) 6-磷酸葡萄糖、檸檬酸和ATP結(jié)合對(duì)G6PDH造成的構(gòu)象變化的疊加圖。

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圖5 氮饑餓和蘇醒期間選定代謝物的豐度。
(A) 氮饑餓前24小時(shí)內(nèi)檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、谷氨酰胺和谷氨酸的相對(duì)代謝物濃度,通過(guò)目標(biāo)LC-MS/MS測(cè)量并與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間的濃度標(biāo)準(zhǔn)化。(B) 蘇醒前24小時(shí)內(nèi)檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、谷氨酰胺和谷氨酸的相對(duì)代謝物濃度,通過(guò)目標(biāo)LC-MS/MS測(cè)量并與氮饑餓期間的濃度標(biāo)準(zhǔn)化。(C) 氮饑餓前24小時(shí)內(nèi)NADPH、NADP+、ATP和ADP的水平,與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間測(cè)量的濃度標(biāo)準(zhǔn)化。

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圖6 在氮饑餓蘇醒期間阻斷GS-GOGAT循環(huán)的效果。

(A)在500 mM MSX處理和未處理的情況下蘇醒開(kāi)始時(shí)的ATP水平。(B)在500 mM MSX處理和未處理的情況下蘇醒開(kāi)始時(shí)的糖原水平。(C)在500 mM MSX處理和未處理的情況下蘇醒期間的細(xì)胞再綠化。(D)野生型和DgltB菌株的恢復(fù)試驗(yàn)。不同的行代表從OD750為1開(kāi)始的黃化培養(yǎng)物的連續(xù)稀釋?zhuān)?00, 10-1, 和 10-2)。

原文

Sofía D., Jakob S., Nathan von M., et al. Metabolite-level regulation of enzymatic activity controls awakening of cyanobacteria from metabolic dormancy[J]Current Biology, 2024, 35: 1-10.

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