近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)在作物研究中取得了重要進(jìn)展。然而，由于農(nóng)業(yè)重要性狀大多是定量性狀，因此編輯啟動(dòng)子以調(diào)控基因表達(dá)強(qiáng)度變得十分重要。真核生物啟動(dòng)子由核心啟動(dòng)子區(qū)域和上游順式調(diào)控元件（CREs）組成。通過靶向多個(gè)CREs來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的改變通常是耗時(shí)的。相反，核心啟動(dòng)子區(qū)域中的突變卻可以引起下游基因轉(zhuǎn)錄本的豐度顯著變化。然而，但受限于序列特征，常用的CRISPR系統(tǒng)通常難以用于核心啟動(dòng)子編輯。最近發(fā)現(xiàn)的FrCas9與TATA PAM兼容，特別是與核心啟動(dòng)子TATA盒序列兼容。然而，F(xiàn)rCas9的活性及其在植物中的編輯模式尚未確定。
近期，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所李娟與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)魏鵬程團(tuán)隊(duì)在aBIOTECH發(fā)表了題為“Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice”的研究論文。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的FrCas9系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)在水稻中進(jìn)行基因編輯，展示了其編輯植物核心啟動(dòng)子區(qū)域的潛力。
為了驗(yàn)證FrCas9系統(tǒng)的核心啟動(dòng)子編輯能力，作者使用TATA盒序列作為PAM，在Nipp（Oryza sativa L.cv Nipponbare）對(duì)白葉枯病菌（Xoo）易感基因OsSWEET13的近端啟動(dòng)子上設(shè)計(jì)sgRNA。此外，為了直接監(jiān)測(cè)編輯活性，設(shè)計(jì)了一個(gè)sgRNA以靶向水稻PDS基因。在48個(gè)PDS轉(zhuǎn)基因植株中，獲得了六個(gè)白化植株，表明FrCas9系統(tǒng)在水稻中具有活性。
為了評(píng)估FrCas9系統(tǒng)編輯TA豐富序列時(shí)的潛力以及在水稻中的編輯表現(xiàn)，作者在水稻PDS基因位點(diǎn)上設(shè)計(jì)了16個(gè)包含所有可能的5'-NNTA-3' PAM的sgRNA，通過對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的高通量測(cè)序表明，F(xiàn)rCas9系統(tǒng)編輯效率范圍從1.1%到35.3%，表明FrCas9的高PAM兼容性。FrCas9系統(tǒng)在TGTA、TATA和AGTA PAM位點(diǎn)編輯效率較高，分別達(dá)到35.3%、33.8%和32.1%，這與NNTA PAM的第二個(gè)核苷酸偏好為R（A/G）的假設(shè)一致。
為了進(jìn)一步測(cè)試FrCas9的核心啟動(dòng)子編輯能力，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有TGTA PAM的sgRNA，靶向水稻Waxy（WX）基因啟動(dòng)子中非典型TATA（TACAAAT）序列。利用FrCas9編輯獲得了WXiA和WXiT純合編輯植株，純合/雙等位突變效率為50%。突變植株中WX表達(dá)量顯著下調(diào)，導(dǎo)致了直鏈淀粉含量（AC）顯著下降。同時(shí)，作者使用TATA為PAM的兩個(gè)相向靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了FrCas9介導(dǎo)的雙向編輯，在核心啟動(dòng)子區(qū)產(chǎn)生多重突變和小片段精確缺失。此外，構(gòu)建了源自FrCas9的堿基編輯器A3A-FrBE3和FrABE8e，并在T0轉(zhuǎn)基因植株中的評(píng)估其性能，結(jié)果顯示其具有較高編輯高精度。
該研究在植物中建立了FrCas9介導(dǎo)的基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)功能基因核心啟動(dòng)子的高效編輯，為基因表達(dá)的微調(diào)和新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了技術(shù)支撐。
Wang H, Ding J, Zhu J, et al, et al. Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice[J]. aBIOTECH, 2024: 1-7.
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