由于全球氣候變化，大多數(shù)農(nóng)田栽培的作物都有面臨嚴(yán)重脅迫的風(fēng)險(xiǎn)，使農(nóng)業(yè)產(chǎn)量大大降低。通過成像技術(shù)對(duì)作物進(jìn)行感知，可以在早期階段檢測(cè)到生物或非生物脅迫，從而避免損害和重大減產(chǎn)。葉綠素a熒光成像技術(shù)是用于植物脅迫檢測(cè)的專業(yè)技術(shù)之一，具有廣泛的國(guó)際認(rèn)可度。它可以評(píng)估葉片的時(shí)空變化，在出現(xiàn)任何肉眼可見癥狀之前就能對(duì)植物生理狀態(tài)進(jìn)行癥狀前監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)高通量評(píng)估。在此，我們將舉例說明如何利用葉綠素a熒光成像分析來評(píng)估生物和非生物脅迫。葉綠素a能夠在甜菜夜蛾攝食后15分鐘、西紅柿植株感染灰霉病后30分鐘檢測(cè)生物脅迫，或缺水脅迫開始時(shí)檢測(cè)非生物脅迫，因此具有早期脅迫檢測(cè)的強(qiáng)大潛力。葉綠素?zé)晒?ChlF)分析是一種快速、非侵入性、易操作、低成本和高靈敏度的方法，可估測(cè)光合作用性能并檢測(cè)各種脅迫對(duì)植物的影響。在 ChlF 參數(shù)方面，開放的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心的比例(qP)可用于早期脅迫檢測(cè)，因?yàn)樽罱脑S多研究發(fā)現(xiàn)它是基于ChlF篩選環(huán)境脅迫對(duì)植物影響的最準(zhǔn)確和最合適的指標(biāo)。
葉綠素是通過捕光天線吸收光能的主要分子。在光合作用的光反應(yīng)中，捕光天線吸收的光能會(huì)被光化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化成電子進(jìn)行傳遞，電子從光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）通過細(xì)胞色素b6f和質(zhì)體藍(lán)蛋白（PC）轉(zhuǎn)移到光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ），最終生成NADPH。除此之外，光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）作為一種大型色素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，還負(fù)責(zé)光合生物中水的光依賴性氧化，釋放分子氧并向類囊體膜內(nèi)釋放質(zhì)子（H+）。質(zhì)子最終通過ATP合酶，合成ATP。NADPH和ATP均可用于光合作用的暗反應(yīng)中CO2的固定和有機(jī)物的合成。
光反應(yīng)的產(chǎn)物ATP和NADPH必須與碳水化合物和其他必需有機(jī)分子的合成相協(xié)調(diào)。否則，會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS）。在光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過程中，活性氧（ROS）在低水平上不斷形成，但它們被不同的抗氧化機(jī)制清除。這些 ROS 是單線態(tài)激發(fā)氧（1O2）、過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子自由基（O2-）。過量的光能吸收肯定會(huì)使電子傳遞鏈容量過度飽和，導(dǎo)致ROS形成的可能性增加。生物和非生物脅迫，如干旱、鹽度、金屬毒性、冷卻、UV-B 輻射、昆蟲和病原體都導(dǎo)致ROS（H2O2， O2-, 1O2，OH）在植物體內(nèi)產(chǎn)生的量增加，這是由于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的破壞，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是由酶促和非酶促抗氧化劑的ROS產(chǎn)生和清除之間的不平衡引起的。這種不平衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，植物需要在細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞之前對(duì)這種不平衡做出反應(yīng)，以維持光合活性和全株存活。葉綠體是植物細(xì)胞中ROS最重要的創(chuàng)造者，尤其是光合作用的光反應(yīng)。在大多數(shù)環(huán)境脅迫條件下，吸收的光能超出其可控制的量，因此會(huì)損害葉綠體。保護(hù)光合設(shè)備免受導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的過量光能的過程是非光化學(xué)淬滅（NPQ）的機(jī)制。植物已經(jīng)發(fā)展了幾種光保護(hù)機(jī)制，包括光通過葉片和葉綠體運(yùn)動(dòng)逸出，NPQ機(jī)制通過吸收的光能作為熱能耗散，PSⅠ周圍的循環(huán)電子傳輸，光呼吸途徑和ROS清除系統(tǒng)。NPQ的產(chǎn)生可以避免在環(huán)境脅迫條件下經(jīng)常觀察到的ROS生成增加。然而，酶促和非酶促抗氧化機(jī)制可以消除環(huán)境脅迫條件下ROS生成的增加。葉綠素?zé)晒夥治龇椒ǚ直媛矢摺⒖焖?、無損、成本低，可以通過監(jiān)測(cè)PSⅡ的葉綠素?zé)晒獍l(fā)射來評(píng)估光化學(xué)的任何變化。該方法可以準(zhǔn)確地確定用于光化學(xué)的能量(ΦPSⅡ)，以熱量(ΦNPQ)，或非穩(wěn)壓耗散在 PSⅡ中(ΦNO)。
植物的葉綠素?zé)晒鈦碜晕盏墓饽苤械囊恍〔糠种匦乱怨獾男问桨l(fā)射，葉綠素?zé)晒饪梢杂脕斫忉屩参锬芰哭D(zhuǎn)換相關(guān)的為光合作用活性，為光合裝置，特別是PSⅡ提供了有價(jià)值的見解。葉綠素分子（Chl）吸收光能將其轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)（Chl*），其能量較高，具體取決于用于照明的光波長(zhǎng)。激發(fā)的葉綠素分子（Chl*）可以以兩種激發(fā)態(tài)存在：?jiǎn)螒B(tài)葉綠素分子（1Chl*），具有相對(duì)短的壽命以及壽命更長(zhǎng)的三態(tài)葉綠素分子（3Chl*）。單線態(tài)激發(fā)態(tài)葉綠素分子（1Chl*）可以通過（i）耗散能量為熱(NPQ)，（ii）將能量轉(zhuǎn)移到另一個(gè)電子受體分子，稱為光化學(xué)（qP），或（iii）以熒光的形式重新發(fā)射為光，葉綠素?zé)晒獠ㄩL(zhǎng)比吸收光更長(zhǎng)。在這些途徑中，可用于去激發(fā)1Chl*的是光化學(xué)反應(yīng)，它將光能轉(zhuǎn)化為電子傳遞用于合成化學(xué)產(chǎn)物。當(dāng)光合作用高效進(jìn)行時(shí)，觀察到的熒光很少。在以下情況下1Chl*不是通過上述途徑去激發(fā)的，它是從高能激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)換而來的1Chl* 至低能激發(fā)態(tài)3Chl*通過內(nèi)部轉(zhuǎn)換或松弛。三態(tài)葉綠素分子（3Chl*）能與分子O2反應(yīng)產(chǎn)生單氧（1O2*），一種非?；顫姷幕钚匝酰≧OS）。在環(huán)境溫度下，大多數(shù)熒光來自與PSⅡ相關(guān)的葉綠素a分子。
葉綠素a熒光可以使用各種方法進(jìn)行檢測(cè)，例如脈沖振幅調(diào)制(PAM)方法。在開始測(cè)量之前，葉片必須經(jīng)過幾分鐘或者幾十分鐘的暗適應(yīng)，這取決于測(cè)量前葉子所處光環(huán)境的光強(qiáng)度和植物物種。黑暗中葉綠素a熒光的最小水平Fo通過低強(qiáng)度測(cè)量光ML獲得，而暗適應(yīng)葉片的最大熒光產(chǎn)量Fm則用飽和光脈沖SP進(jìn)行評(píng)估。在光化光照明AL（即施加的光強(qiáng)度）下，可以使用另一個(gè)飽和脈沖估計(jì)光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光Fm′。在施加的光化光AL關(guān)閉之前測(cè)量熒光的穩(wěn)態(tài)水平Fs。除此之外，在關(guān)閉AL后，開可以測(cè)到另一個(gè)葉綠素?zé)晒獾淖畹退紽o′。Fm′和Fo′之間的差異是光下的最大可變熒光Fv′。根據(jù)這些測(cè)量的基本葉綠素?zé)晒鈪?shù)，可以計(jì)算出其他一些更常用于葉綠素?zé)晒夥治龅膮?shù)。
脈沖振幅調(diào)制葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量過程示意圖葉綠素?zé)晒獬上裼糜诜巧飸?yīng)激檢測(cè)
水分充足（對(duì)照）的擬南芥（a）和缺水脅迫開始時(shí)（對(duì)照植株土壤容積含水量的 95-96%, SWC）的擬南芥（b）葉片上開放的 PSⅡ 反應(yīng)中心（qP）的差異。右側(cè)的顏色代碼表示qP值，范圍從0到1。
在0 μM（對(duì)照）、40 μM或 120 μM Cd2+ 脅迫條件下生長(zhǎng)3天和4天的Noccaea caerulescens植株。圖中顯示了開放的PSⅡ反應(yīng)中心的比例（qP）。右側(cè)的顏色代碼顯示 qP值的范圍為0.0至1.0。
Noccaea caerulescens中開放的PSⅡ反應(yīng)中心部分（qP）對(duì)鎘暴露的U型雙相響應(yīng)曲線。在 40 μM 的鎘濃度下暴露3天后，觀察到開放的 PSⅡ 反應(yīng)中心(qP)的比例下降，而暴露時(shí)間更長(zhǎng)(4 d)后，由于誘導(dǎo)了應(yīng)激防御反應(yīng)，qP增加。同樣的120 μM Cd暴露時(shí)間（3天）導(dǎo)致qP增加。這種激素反應(yīng)被認(rèn)為是由ROS水平的增加引發(fā)的，而ROS 被認(rèn)為有利于引發(fā)防御反應(yīng)。
生物脅迫下番茄葉片的葉綠素?zé)晒獬上窠Y(jié)果。其中每個(gè)像素的顏色代表 Spodoptera exigua 幼蟲取食前（a）和取食15分鐘后（b）番茄小葉中Fm（暗適應(yīng)最大葉綠素a熒光）。(a)中用圓圈表示取食前的十個(gè)感興趣區(qū)域（AOIs），(b)中為相同的感興趣區(qū)域、兩個(gè)取食點(diǎn)（星號(hào)表示）和另外五個(gè)感興趣區(qū)域（箭頭表示）。白色箭頭所指的取食點(diǎn)覆蓋了整個(gè) AOI。黑色箭頭指向現(xiàn)有AOI附近的周圍區(qū)域。AOI 的圓圈上有紅色標(biāo)簽，標(biāo)注了其所在位置的Fm值。右側(cè)的顏色代碼顯示Fm值的范圍為0.0至0.4。
茄科植物小葉在被Spodoptera exigua幼蟲取食前（0分鐘）和取食 15、90和180分鐘后的ΦPSⅡ、ΦNPQ和ΦNO的彩色圖片。取食前的AOIs用圓圈表示，而相同的AOIs、三個(gè)取食點(diǎn)的AOIs（用星號(hào)和箭頭表示）以及取食區(qū)周圍的AOIs區(qū)則用圓圈表示。AOI的圓圈上還用紅色標(biāo)簽標(biāo)注了相應(yīng)的參數(shù)值。右側(cè)的顏色代碼顯示了參數(shù)值的范圍為0.0至0.5。
在植物表型分析中利用現(xiàn)有成像工具具有巨大潛力，可以加快我們對(duì)植物功能的認(rèn)識(shí)。這些工具可以建立基因功能與環(huán)境反應(yīng)之間在代謝、生化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等多個(gè)途徑上的聯(lián)系。在這些工具中，葉綠素?zé)晒獬上?ChlF Imaging)分析是一種快速、非侵入性、高成本效益和高靈敏度的方法。這種方法能精確估計(jì)光合作用的性能，并能檢測(cè)植物受到的各種脅迫影響。葉綠素?zé)晒獬上褡鳛橐环N在肉眼可見的癥狀出現(xiàn)之前檢測(cè)生物和非生物脅迫的技術(shù)，其潛力已在園藝領(lǐng)域得到證實(shí)，并已有效地應(yīng)用于采收前和采收后的各種情況。葉綠素?zé)晒獬上褡鳛橐环N技術(shù)，對(duì)于研究生物和非生物脅迫因素下葉片光合作用的異質(zhì)性特別有價(jià)值，而且還能篩選大量樣本，提供早期脅迫檢測(cè)診斷。然而，該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究仍然至關(guān)重要，其最終目的是加快農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。葉綠素?zé)晒夥治龇椒捎糜跇?gòu)建各種作物品種的綜合脅迫耐受性數(shù)據(jù)庫，以便根據(jù)環(huán)境條件優(yōu)化光合功能，應(yīng)對(duì)氣候變化，從而提高作物產(chǎn)量。在各種葉綠素?zé)晒獬上竦膮?shù)中，開放的PSⅡ反應(yīng)中心的比例（qP）被認(rèn)為是最適合用于早期脅迫檢測(cè)的指標(biāo)。最近的研究一致發(fā)現(xiàn)qP具有很高的靈敏度，非常適合用于探測(cè)光合作用的功能，可在早期評(píng)估非生物和生物脅迫對(duì)植物的影響。我們建議科學(xué)家在進(jìn)一步的研究中考慮將QA 氧化還原狀態(tài)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)納入其工作中。本研究中葉綠素?zé)晒獬上竦膱D片由IMAGING-PAM獲得。? Moustaka, J.; Moustakas, M. Early-Stage Detection of Biotic and Abiotic Stress on Plants by Chlorophyll Fluorescence Imaging Analysis. Biosensors, 2023, 13, 796.
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