水稻稻曲病（RFS）是由獨特的花器官侵染性真菌病原體引起，已成為全世界水稻生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害。該病害不僅會造成巨大的產(chǎn)量損失（高達(dá)40%），還產(chǎn)生各種類型的霉菌毒素，污染稻谷，降低稻谷質(zhì)量。近年來，盡管一些研究推測RFS與水稻花序性狀相關(guān)，特別是與大花序、直立花序以及密集性花序等性狀有關(guān)，但沒有具體的相關(guān)研究來進(jìn)一步證明這一猜測。

近日，福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的研究團(tuán)隊在《BMC Plant Biology》在線發(fā)表了題為“SPR9 encodes a 60 S ribosomal protein that modulates panicle spreading and affects resistance to false smut in rice (Oryza sativa. L)”的研究論文，介紹了研究團(tuán)隊基于突變體圖位克隆了一個調(diào)控水稻花序展開的新基因SPR9，該基因編碼一個60S核糖體蛋白，同時影響水稻稻曲病抗性。該基因在水稻抗稻曲病和穗型改良育種方面有很好應(yīng)用前景。

為了闡明參與水稻小穗發(fā)育的調(diào)控基因，研究團(tuán)隊篩選并獲得了一個展開穗型的R20-1遺傳背景spr9突變體（圖1a）。將spr9突變體和野生型R20-1之間的表型進(jìn)行比較，株高、穗長、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、籽粒長度和寬度都沒有顯著差異（圖1b-i）。

圖1 spr9突變體和野生型R20-1的表型比較

前人研究提出水稻的穗型與稻曲病抗性有一定的關(guān)系。為了進(jìn)一步比較spr9突變體和R20-1在稻曲病抗性方面是否有差異，研究團(tuán)隊用人工注射的方式接種了 spr9突變體和R20-1植株。結(jié)果表明，spr9突變體的病情指數(shù)為3，R20-1的病情指數(shù)為4，這說明spr9突變體比R20-1的稻曲病抗性更強(qiáng)（圖2a、b）。

圖2 U. virens侵染后spr9突變體和野生型R20-1的病癥表現(xiàn)

研究團(tuán)隊通過遺傳模式分析實驗發(fā)現(xiàn)spr9突變體是隱性核遺傳，且由一個單基因控制。為了找到spr9突變體的功能基因，研究團(tuán)隊利用spr9突變體和粳稻栽培品種Hui1586的雜交群體以及253個SSR多態(tài)性標(biāo)記，找到了與性狀共分離的5號染色體上的標(biāo)記RM8211和RM5970，并通過重組單株鑒定，將候選基因初定位在了標(biāo)記RM8211和RM597之間，其遺傳距離為16.5 cM（圖3a）。通過在候選區(qū)段內(nèi)加密分子標(biāo)記，篩選重組單株進(jìn)行性狀鑒定，研究團(tuán)隊最終將候選基因定位在了分子標(biāo)記Indel5-18和Indel5-22之間物理距離為43kb的區(qū)段（圖3b-d）。

研究團(tuán)隊對候選基因區(qū)段進(jìn)行基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)在43kb的區(qū)域總共有6個能夠正常轉(zhuǎn)錄全長cDNA的候選基因（圖3e）。研究團(tuán)隊比較6個候選基因在spr9突變體與R20-1野生型的序列結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)6個候選基因中只有LOC_Os05g38520基因有1bp的插入/缺失變異（圖3f），這意味著該基因很有可能是SPR9的功能基因，有三個外顯子和兩個內(nèi)含子。

圖3 候選基因的圖位克隆與結(jié)構(gòu)比較

為了確定spr9在粳稻遺傳背景的表現(xiàn)，研究團(tuán)隊利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除了栽培粳稻品種Hui1586中的SPR9基因，總共獲得了三個獨立的轉(zhuǎn)基因事件，并通過測序確定了編輯的有效性（圖4a）。三個基因編輯株系與spr9突變體的表現(xiàn)一致，均表現(xiàn)出穗型展開的性狀（圖4b），且株高、穗長、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、籽粒長度和寬度等農(nóng)藝性狀差異不顯著，這表明Hui1586中SPR9基因的敲除會導(dǎo)致穗型展開的表型，spr9基因是展開穗型的spr9突變體的功能基因。

圖4 敲除轉(zhuǎn)基因單株與spr9突變體性狀一致

為了進(jìn)一步了解SPR9基因的功能，研究團(tuán)隊利用RT-qPCR技術(shù)檢測水稻不同發(fā)育階段SPR9基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，SPR9基因在所有組織中都有表達(dá)，包括2/4周齡的根、莖、葉，0.5-1cm、1-3cm、3-5cm、5-10cm長的花穗，以及萌發(fā)的種子、成熟的種子和愈傷組織。但SPR9基因主要在萌發(fā)的種子和5-10cm長花穗中表達(dá)（圖5）。

圖5 SPR9基因的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步分析SPR9蛋白的定位，研究團(tuán)隊構(gòu)建了35S：SPR9-pSuper1300-GFP載體，并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中。注射侵染煙草葉片后三天，用激光共聚焦顯微鏡觀察SPR9蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示SPR9蛋白在定位在細(xì)胞核中（圖6）。

圖6 SPR9蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果

綜上所述，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)了一個新型水稻穗型控制基因SPR9，編碼具有核定位信號的核糖體蛋白。CRISPR/Cas9基因敲除實驗證實，SPR9基因是spr9突變體的功能基因。重要的是，spr9突變體提高了對RFS的抗性，而不影響主要的農(nóng)藝性狀，這表明spr9基因在未來的水稻稻曲病抗性及穗型改良應(yīng)用中潛力巨大。

—— 參考文獻(xiàn) ——

He, N., Huang, F., Lu, L. et al. SPR9 encodes a 60 S ribosomal protein that modulates panicle spreading and affects resistance to false smut in rice (Oryza sativa. L)[J]. BMC Plant Biology, 2023, 23, 205.

北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺。中心建立了基因克隆和載體平臺、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺、表型鑒定分析平臺、數(shù)據(jù)分析和利用平臺等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺，是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺。

分子標(biāo)記開發(fā)與檢測服務(wù)

根據(jù)目標(biāo)DNA/基因序列,可開發(fā)高效的分子標(biāo)記（SNP-KASP、SSR等），并可實現(xiàn)單日最高一萬SSR數(shù)據(jù)點，以及數(shù)以十萬計的SNP數(shù)據(jù)點檢測。應(yīng)用領(lǐng)域：

分子標(biāo)記輔助選擇/回交育種服務(wù)

利用分子標(biāo)記輔助目標(biāo)基因選擇、背景選擇和去連鎖選擇，針對優(yōu)良自交系的個別“短板”進(jìn)行“定向”改良，回交不超過3代，獲得與原自交系一致或高度相似的新材料。應(yīng)用領(lǐng)域：水稻、玉米、大豆、小麥等作物定向改良。