水稻稻曲?。≧FS)是由獨特的花器官侵染性真菌病原體引起,已成為全世界水稻生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害。該病害不僅會造成巨大的產(chǎn)量損失(高達40%),還產(chǎn)生各種類型的霉菌毒素,污染稻谷,降低稻谷質(zhì)量。近年來,盡管一些研究推測RFS與水稻花序性狀相關(guān),特別是與大花序、直立花序以及密集性花序等性狀有關(guān),但沒有具體的相關(guān)研究來進一步證明這一猜測。
近日,福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的研究團隊在《BMC Plant Biology》在線發(fā)表了題為“SPR9 encodes a 60 S ribosomal protein that modulates panicle spreading and affects resistance to false smut in rice (Oryza sativa. L)”的研究論文,介紹了研究團隊基于突變體圖位克隆了一個調(diào)控水稻花序展開的新基因SPR9,該基因編碼一個60S核糖體蛋白,同時影響水稻稻曲病抗性。該基因在水稻抗稻曲病和穗型改良育種方面有很好應(yīng)用前景。
為了闡明參與水稻小穗發(fā)育的調(diào)控基因,研究團隊篩選并獲得了一個展開穗型的R20-1遺傳背景spr9突變體(圖1a)。將spr9突變體和野生型R20-1之間的表型進行比較,株高、穗長、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、籽粒長度和寬度都沒有顯著差異(圖1b-i)。
圖1 spr9突變體和野生型R20-1的表型比較
前人研究提出水稻的穗型與稻曲病抗性有一定的關(guān)系。為了進一步比較spr9突變體和R20-1在稻曲病抗性方面是否有差異,研究團隊用人工注射的方式接種了 spr9突變體和R20-1植株。結(jié)果表明,spr9突變體的病情指數(shù)為3,R20-1的病情指數(shù)為4,這說明spr9突變體比R20-1的稻曲病抗性更強(圖2a、b)。
圖2 U. virens侵染后spr9突變體和野生型R20-1的病癥表現(xiàn)
研究團隊通過遺傳模式分析實驗發(fā)現(xiàn)spr9突變體是隱性核遺傳,且由一個單基因控制。為了找到spr9突變體的功能基因,研究團隊利用spr9突變體和粳稻栽培品種Hui1586的雜交群體以及253個SSR多態(tài)性標(biāo)記,找到了與性狀共分離的5號染色體上的標(biāo)記RM8211和RM5970,并通過重組單株鑒定,將候選基因初定位在了標(biāo)記RM8211和RM597之間,其遺傳距離為16.5 cM(圖3a)。通過在候選區(qū)段內(nèi)加密分子標(biāo)記,篩選重組單株進行性狀鑒定,研究團隊最終將候選基因定位在了分子標(biāo)記Indel5-18和Indel5-22之間物理距離為43kb的區(qū)段(圖3b-d)。
研究團隊對候選基因區(qū)段進行基因功能注釋,發(fā)現(xiàn)在43kb的區(qū)域總共有6個能夠正常轉(zhuǎn)錄全長cDNA的候選基因(圖3e)。研究團隊比較6個候選基因在spr9突變體與R20-1野生型的序列結(jié)構(gòu)差異,發(fā)現(xiàn)6個候選基因中只有LOC_Os05g38520基因有1bp的插入/缺失變異(圖3f),這意味著該基因很有可能是SPR9的功能基因,有三個外顯子和兩個內(nèi)含子。
圖3 候選基因的圖位克隆與結(jié)構(gòu)比較
為了確定spr9在粳稻遺傳背景的表現(xiàn),研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除了栽培粳稻品種Hui1586中的SPR9基因,總共獲得了三個獨立的轉(zhuǎn)基因事件,并通過測序確定了編輯的有效性(圖4a)。三個基因編輯株系與spr9突變體的表現(xiàn)一致,均表現(xiàn)出穗型展開的性狀(圖4b),且株高、穗長、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、籽粒長度和寬度等農(nóng)藝性狀差異不顯著,這表明Hui1586中SPR9基因的敲除會導(dǎo)致穗型展開的表型,spr9基因是展開穗型的spr9突變體的功能基因。
圖4 敲除轉(zhuǎn)基因單株與spr9突變體性狀一致
為了進一步了解SPR9基因的功能,研究團隊利用RT-qPCR技術(shù)檢測水稻不同發(fā)育階段SPR9基因的表達模式。結(jié)果顯示,SPR9基因在所有組織中都有表達,包括2/4周齡的根、莖、葉,0.5-1cm、1-3cm、3-5cm、5-10cm長的花穗,以及萌發(fā)的種子、成熟的種子和愈傷組織。但SPR9基因主要在萌發(fā)的種子和5-10cm長花穗中表達(圖5)。
圖5 SPR9基因的表達模式
為了進一步分析SPR9蛋白的定位,研究團隊構(gòu)建了35S:SPR9-pSuper1300-GFP載體,并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中。注射侵染煙草葉片后三天,用激光共聚焦顯微鏡觀察SPR9蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示SPR9蛋白在定位在細(xì)胞核中(圖6)。
圖6 SPR9蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果
綜上所述,研究團隊發(fā)現(xiàn)了一個新型水稻穗型控制基因SPR9,編碼具有核定位信號的核糖體蛋白。CRISPR/Cas9基因敲除實驗證實,SPR9基因是spr9突變體的功能基因。重要的是,spr9突變體提高了對RFS的抗性,而不影響主要的農(nóng)藝性狀,這表明spr9基因在未來的水稻稻曲病抗性及穗型改良應(yīng)用中潛力巨大。
—— 參考文獻 ——
He, N., Huang, F., Lu, L. et al. SPR9 encodes a 60 S ribosomal protein that modulates panicle spreading and affects resistance to false smut in rice (Oryza sativa. L)[J]. BMC Plant Biology, 2023, 23, 205.
北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺。中心建立了基因克隆和載體平臺、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺、表型鑒定分析平臺、數(shù)據(jù)分析和利用平臺等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺,是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺。
分子標(biāo)記開發(fā)與檢測服務(wù)
根據(jù)目標(biāo)DNA/基因序列,可開發(fā)高效的分子標(biāo)記(SNP-KASP、SSR等),并可實現(xiàn)單日最高一萬SSR數(shù)據(jù)點,以及數(shù)以十萬計的SNP數(shù)據(jù)點檢測。應(yīng)用領(lǐng)域:
● 玉米、大豆、水稻等作物品種真實性鑒定 | ● 基因精細(xì)定位 |
● 玉米、大豆、水稻等作物品種一致性檢測 | ● 種質(zhì)資源分析 |
● 玉米、大豆、水稻等作物品種純度檢測 | ● 分子標(biāo)記輔助育種 |
分子標(biāo)記輔助選擇/回交育種服務(wù)
利用分子標(biāo)記輔助目標(biāo)基因選擇、背景選擇和去連鎖選擇,針對優(yōu)良自交系的個別“短板”進行“定向”改良,回交不超過3代,獲得與原自交系一致或高度相似的新材料。應(yīng)用領(lǐng)域:水稻、玉米、大豆、小麥等作物定向改良。